微生物与新能源新材料的开发幻灯片.ppt

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1、微生物与新能源新材料的开发第1页，共48页，编辑于2022年，星期六常规的一次采油是油井建成之后，靠地层压力将原油压至地面，能开采出原油总量的30%左右；二次采油需加压、注水、注气等，靠水或气体的流动将油从油井驱至地面，能获得总储量的10%-20%；剩余在油藏中的石油由于吸附在岩石空隙间，难以开采，因此需要用新的方法将其开采出来，这就需要三次采油。三次采油的主要机理是降低原油粘度，或者增加注入水的粘度，缩小油水之间的粘度差，控制水的流动性，提高驱油面积，从而提高原油的采收率。常规的三次采油方法有：热驱、蒸汽驱油、化学驱油(包括表面活性剂驱油和聚合物驱油)，以及微生物采油。第2页，共48页，编辑

2、于2022年，星期六常规的化学驱动费用都比较昂贵，而微生物采油随着生物技术的发展，已经向着经济开采原油的目标迈出了可喜的第一步。利用微生物开采枯竭的油层是目前最经济的方法。应用这种方法不仅可以开采出流动的原油，而且可以开采出不流动的石油，并能使枯竭井延长使用寿命。多年以来的研究证明：微生物采油是一种最有前途的强采方法。微生物采油的历史：1926年，美国石油工程师Beckmen最早提出。20世纪40年代，美国海洋微生物学家C.E.Zobell报道硫酸盐还原菌可提高实验室模型系统的石油采收率。1943-1953年，就微生物对石油成因的作用和原油成分的作用进行了系统研究。并开始了微生物提高采收军的技

3、术研究。20世纪70年代后，微生物采油技术逐渐从室内微生物过程评价走向全球现场应用。我国最近几年一些高等院校如山东大学、南开大学等相继与胜利油田、大庆油田、大港油田等合作开展了这项技术研究，取得了一定的成果。第3页，共48页，编辑于2022年，星期六微生物采油的主要优点主要优点：施工成本低。施工工艺简单，操作方便，操作方式灵活多变，容易控制生态学优势。增产效果持续时间长。使用范围广。一、微生物采油一、微生物采油（一）微生物采油的机理及特点（二）微生物采油的应用方法分类（三）微生物采油的局限和存在的问题（四）微生物采油的现状和发展前景第4页，共48页，编辑于2022年，星期六（一）微生物采油的机

4、理及特点（一）微生物采油的机理及特点(1)微生物的直接作用 通过在岩石表面上的生长繁殖，占据孔隙空间，用物理的方法驱出石油，改变碳氢化合物的馏分。微生物能粘附到岩石表面，在油膜下生长，最后把油膜推开，使油释放出来。(2)改变原油的组成 通过降解原油，使具变成低粘度的原油。微生物以石油中正构烷烃作为碳源而生长繁殖，从而改变原油的碳链组成，使原油粘度降低而变得容易流动。微生物不断老化，改变了石蜡基原油的物理性质，影响了原油液或固相的平衡，降低了石蜡基原油的临界温度和压力。(3)改变原油的驱油环境生物表面活性剂提高果收率。生物气提高果收率。产生酸及有机溶剂提高采收率。生物聚合物提高采收率。(4)综合

5、作用第5页，共48页，编辑于2022年，星期六微生物采油的特点：烃氧化菌对原油中石蜡的降解作用。微生物的新陈代谢可产生脂肪酸、糖脂、类脂体等多种生物表面活性。微生物自身具有黏附在金属或粘土矿物表面的特性，能够在金属或粘土矿物表面形成保护膜，因此具有屏蔽晶核、阻止结晶的作用。石微生物的新陈代谢过程中，产生大量乙醇、乙醛和有机酸等，它们可使重质组分在原油系统中的溶解度大大增加。在油层条件下，所筛选的菌种以原油为惟一碳源，生长、繁殖良好。微生物能氧化降解原油，使轻组分增加了30%以上，并能产生有机酸和活性物质等，降低界面张力。物理模拟实验表明，在水驱采油之后微生物驱可以提高采收率达10%原油储量(O

6、OIP)左右。第6页，共48页，编辑于2022年，星期六（二）微生物采油的应用方法分类（二）微生物采油的应用方法分类单井周期注入微生物采油技术微生物驱油激活油藏微生物群落驱油微生物选择性封堵微生物压裂液压裂微生物油井清蜡。单井周期注入微生物采油技术的局限性局限性：产能低、渗透率低的油井不适应单井吞吐。易出砂井，不宜采用单井吞吐。黏土含量高的油层不宜采用。高温高压井不宜采用微生物开采。采用的微生物主要有芽孢杆菌，羧状芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌。第7页，共48页，编辑于2022年，星期六4微生物选择性封堵微生物封堵油层的机理是；将形体较大，且产生表面粘稠物质的微生物菌种从注水井注入，微

7、生物可以运移到大孔道或有溶洞的储油岩层部位，通过微生物的生长繁殖和代谢作用，产生大菌体细胞和细胞分泌的表面站稠物质，在地层的岩石表面形成一层生物膜，高效地封堵大孔道或溶洞，降低地层的渗透率。主要使用的微生物葡聚糖-球菌，硝酸盐还原菌，肠膜明串珠菌等。也可用活性污泥中的微生物5、微生物压裂液压裂将在厌氧条件下大量产生有机酸的微生物及营养物高压注入孔限度甚小、渗透率很低的储油层，微生物生长过程中产生大量有机酸，可以溶解岩层使之形成缝隙，提高渗透率，利于原油流动，提高原油果收率。利用微生物压裂液压裂地层技术施工时，需先将所用的菌株及营养物注入地下油层，再用凝胶填充油管和产层附近的空间，然后加压，当压

8、裂后，油层的压力降低，关井数月后，再次开采，此时的产油量将大大增加。第8页，共48页，编辑于2022年，星期六 6、微生物油井清蜡原油中含有一定比例的蜡，在原油的采出过程中，随着温度、压力的降低，原油中的蜡会结晶析出，析出的蜡晶凝结在井壁上，堵塞储油层通往井壁的孔隙通道，降低原油流动性，降低单井原油日产量，从而严重影响原油的开采。用微生物法防蜡的机理可以简单地概括为以下几点：一是通过微生物的代谢产物(表面活性剂或溶剂)的作用，使油管内壁及抽油竿表面形成亲水膜，使蜡不容易被吸附；二是通过微生物对蜡的利用而使长链蜡降解；三是通过微生物产生的某些表面活性剂类物质，降低油-水界面张力，改变蜡的蜡晶状态

9、，阻压蜡的凝结，起到防蜡作用。另外，用表面活性剂、乳化剂清洗井壁，可以溶解固形石蜡，提高原油的采收率。因此，利用微生物进行防蜡及除蜡，是一种行之有效的方法。第9页，共48页，编辑于2022年，星期六（三）微生物采油的局限和存在的问题（三）微生物采油的局限和存在的问题局限性：对于高温(89)或高含盐量(10%)的地层通常不能适用；营养基中有时含有一定量的重金属离子，可能对微生物有副作用；需进行实验室配伍性试验以及合理的工程设计，目采油机理尚未完全探明证实；对特定油层的最佳微生物应用工艺尚在建立之中；油田应用的筛选标准仍需不断改进；能可靠预测现场过程的地层模拟技术尚未开发。存在的问题存在的问题宏观

10、上：1)仅仅依赖于筛选，因而菌种单一；2)缺乏评价和监测规范以及可工业化应用的数模软件，导致矿场方案的科学化程度不高；3)对油藏环境中微生物的生态认识不够，因而在确定注入体系时缺乏依据.微(介)观上：1)对微生物驱油特有过程的关注不够；2)分子层次的研究工作少，包括从分子层次对菌种的研究、油藏环境中微生物的分子生态、分子层次的驱油机制等；3)对微生物与油藏环境适应性认识不够.第10页，共48页，编辑于2022年，星期六（四）微生物采油的现状和发展前景（四）微生物采油的现状和发展前景石油微生物发展方向：石油微生物发展方向：油田区系的微生物资源调查高效采油菌种的分子生物学构建微生物采油机理的深入探

11、讨原油降粘、破乳等边缘技术的建立油田生态环境的生物修复其它配套工程技术的完善二、微生物代谢产物采油二、微生物代谢产物采油（一）微生物代谢产物采油的方法和分类（二）微生物采油和微生物产物采油的比较（三）微生物产物采油的应用前景第11页，共48页，编辑于2022年，星期六 微生物产物采油技术，即地上微生物采油法，是在地面上建立发酵反应罐，为微生物生长代谢提供必需的营养物质，通过微生物的代谢作用产生生物物质(主要是生物表面活性剂和生物多糖聚合物)，将这些生物物质分离、纯化后注入地层，可以降低原油的粘度，从而达到提高采收率的目的。该技术的实质是利用选育的优良菌种在地上发酵生产采油制剂。这种方法的优点是

12、发酵过程在地面上进行，微生物的生长和代谢不受地层条件的影响。缺点就是成本较高。第12页，共48页，编辑于2022年，星期六（一）微生物代谢产物采油的方法和分类（一）微生物代谢产物采油的方法和分类根据采油中应用的微生物代谢产物的不同，分别介绍用微生物聚合物采油和用微生物产生的表面活性剂采油。微生物聚合物采油：采油亨可以应用的水溶性聚合物很多，但形成一定使用规模的聚合物只有两神，一种是化学合成的聚合物聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺，目前在石油工业上所使用的水溶性聚合物中，聚丙烯酰胺仍处于十分重要的地位，它易溶解，有很好的增粘性，价格便宜，且易于现场使用，另一种是生物聚合物黄原胶黄原胶。尽管在石油工业上应用的

13、生物聚合物种类很多，但目前在聚合物驱油和堵水调剖方面具有应用价值的只有黄原胶。国内南开大学、山东大学、中科院微生物研究所等单位已研制出了适于三次采油的国产黄原胶，性能基本达到或接近国外同类产物的水平。驱油模拟实验表明，国产黄原胶驱油比水驱可提高采收率8%-12%。国产黄原胶经与三价铬离子交联改性处理，在河南南阳油田进行了注水共调剖提高采收率的试验。结果表明，注水井吸水剖面得到调整，获得了明显的增油降水效果。第13页，共48页，编辑于2022年，星期六表面活性剂采油：用微生物生产表面活性剂是20世纪70年代后期国际生物工程领域中发展起来的一个新课题。加拿大、英国、德国、前苏联等国家先后进行了研究

14、与开发。生物表面活性剂的空产成本低，目成本仅为合成表面活性剂的30%。因此，使用生物表面活性剂比使用人工合成表面活性剂经济得多。微生物生产的表面活性剂主要用于驱油。生物表面活性剂可很容易地溶解在地层和注入水中，在油-水界面上具有较高的表面活性，能很好地润湿含油岩石的表面，能从岩石表面洗掉油膜；分散原油的能力强，在固体表面上的吸附量少，所以驱油能力强。研究表明，生物表面活性剂的驱油效率比人工合成表面活性剂的驱油效率要高3.5-8倍。中科院上海有机化学研究所是我国国内首创研究生物表面活性剂的单位。已研究出4种类型的糖脂型化合物，如槐糖脂、海藻糖脂和多糖脂等。用这些表面活性剂可提高残余油采收率15%

15、，显示了良好的应用前景，达到了国外同类技术研究水平。第14页，共48页，编辑于2022年，星期六（二）微生物采油和微生物产物采油的比较（二）微生物采油和微生物产物采油的比较从理论上看，微生物采油似乎比较简单，但在实际应用中会遇到一系列的问题。因为该方法需要将筛选好的菌种注入多孔岩层，而其中的菌体如处理不当可能会堵塞岩层；而且油层是一个极端的环境，油层的环境条件对微生物的活性起着严格的限制作用。微生物采油的成本低，设备简单。而微生物产物采油成本高，需要一系列发酵设备。（三）微生物产物采油的应用前景（三）微生物产物采油的应用前景从1986年开始，上海有机化学研究所经微生物菌种筛选和选育，已研制出槐

16、糖脂、海藻糖脂、多糖脂等多种糖脂型表面活性剂。中国科学院渗流力学研究所对上海有机化学研究所提供的6种生物表面活性剂进行了筛选和配制试验。以鼠李糖脂为母液，成功地配制了低界面张力的表面活性剂稀体系。该体系经松散砂型物理模型试验表明，采收率比水驱提高提高20%-25%，抗盐性、耐漏性均好。第15页，共48页，编辑于2022年，星期六大庆油田使用海藻糖脂-碱二元体系可使大庆原油的界面张力降为0.3mN/m，用该体系驱油可提高残余油采收率15%，显示了良好的应用前景。已经报道的可以在采油中使用的生物聚合物虽然不多，但是利用黄原胶采油现在已经得到了广泛的应用，并且取得了较好的效果。而且，由于其众多的优点

17、，它将会得到更广泛的应用，而且有可能取代聚丙烯酰胺成为新一代的采油聚合物。三、石油微生物脱硫（三、石油微生物脱硫（BDS）（一）石油的组成与脱硫简介（一）石油的组成与脱硫简介（二）脱硫机理及有关微生物（二）脱硫机理及有关微生物（三）生物脱硫的工业应用及发展前景（三）生物脱硫的工业应用及发展前景第16页，共48页，编辑于2022年，星期六（一）石油的组成与脱硫简介（一）石油的组成与脱硫简介 石油一般是天然的气体、液体和固体混合物，主要成分是碳氢化合物碳氢化合物，而硫在石油中被认为是仅次于碳和氢的第3种元素。石油的总含硫量在0.03%-7.89%之间，除元素硫、硫化物外，还有硫醌、噻吩、苯并噻吩、

18、二苯基噻吩类及更复杂的含硫有机化合物约200种。无机硫及沸点较低的含硫有机物很容易脱去，而沸点较高的二苯并噻吩(DBT)及其衍生物是典型的难脱除有机硫的代表物，常被用为模型化合物评价脱硫效果。目前虽然已有多种方法脱出燃料中的硫，但是传统的物理分离方法只能脱出无机硫，而化学法脱硫过程需要在高温、高压、催化加氢（HDS）等苛刻条件下进行，成本和操作费用很高，此外这些方法催化杂环分子中的硫时效果不好。而微生物在漫长地道化过程中已经形成了多种多样的对付环境中的硫的生化机制。生物学家和工程师们正在利用这些硫专一性途径来应付与硫有关的环境问题。第17页，共48页，编辑于2022年，星期六（二）脱硫机理及有

19、关微生物（二）脱硫机理及有关微生物脱除无机硫脱除无机硫的微生物主要是化能自养菌如硫杆菌属和嗜热硫化裂片菌属中的一些细菌。这些菌氧化无机硫化物有间接作用和直接作用两种。间接作用机理为细菌氧化Fe2+，生成的强氧化剂Fe3+再将硫化物氧化成S，然后Fe2+又被氧化，沉积在石油中的硫再被Fe3+氧化生成水溶性硫酸盐；直接氧化的机理则为细菌直接与硫化物的含硫部位接触，在细菌生物膜内作用生成还原型谷胱甘肽(GSH)的二硫衍生物GSSH，GSSH被氧化酶氧化并水解成亚硫酸盐，亚硫酸放又被氧化为硫酸盐。脱除有机硫，以MBT为例：主要微生物：脱硫弧菌，假单孢菌，短杆菌，棒状杆菌等。主要脱硫机制DBT的C-C被

20、专一氧化而C-S键依然保留。直接氧化C-S键生成苯甲酸酯途径专一切断C-S键生成联苯途径第18页，共48页，编辑于2022年，星期六生物脱硫技术工业化的障碍在于催化剂的活性、稳定性和发酵产率方面。然而，1990年以来，美国ENEC公司通过生物催化产品的优化，DszA、DszB、DszC浓度的提高，DszD的优化和DszB的剔除等方法，使重组BDS催化剂的活性提高了200倍，寿命提高了10倍以上，催化剂的发酵产率也由起初的1g/L提高到60g/L，脱硫速率基本上达到了BDS商业化应用所需要的数量级。（三）生物脱硫的工业应用及发展前景三）生物脱硫的工业应用及发展前景基因工程在BDS技术中的应用分子

21、生物学和代谢工程尚未解决的代谢问题：如这些疏水性的分子是如何到达参与反应的第一个酶的；细胞怎样将产物运到胞外的等。如何工业应用问题：虽然近10年来，BDS技术取得了很大的进展，但在实现工业化之前仍有很多问题需要解决，存在的问题主要有两个方面：一是生物催化剂的发展，如细菌对含硫杂环芳烃的代谢机理还不十分清楚，生物催化剂性能仍有待于提高，包括催化剂活性、选择性和寿命等；菌种的选择、生物催化剂的生产和再生等问题。二是BDS技术的工艺和工程问题：包括新型生物反应器的设计、分离技术(油、水和生物催化剂的分离)、副产品的处理，以及如何提高产品的质量等。第19页，共48页，编辑于2022年，星期六2 燃料乙

22、醇的开发燃料乙醇的开发植物纤维原材料的预处理技术纤维素酶的生产与纤维素水解乙醇发酵菌株的选育与工程菌的构建发酵工艺的选择石油资源的大量消耗和逐步枯竭对人类社会发展造成的最直接威胁是液体燃料的持续供应问题，因而燃料乙醇的发酵生产就成为生物质资源开发的主攻方向。本章将以纤维素类资源的生物转化生产酒精技术为主线，介绍相关的研究进展。纤维素类物质转化为燃料和化工原料的关键问题在于纤维素类聚合物的降解，所以本节主要介绍纤维素类聚合物如何转化成单体的。第20页，共48页，编辑于2022年，星期六燃料酒精工业的市场条件已经逐步成熟了。发展燃料酒精工业具有重大的战略意义：有利于环境保护与可持续发展，能改善大中

23、城市大气质量。特别是从整个二氧化碳循环周期看，由生物质生产燃料酒精形成了基本上封闭的碳循环，没有二氧化碳净排放，有利于减少温室效应。有利于减少成品油进口重，降低国民经济发展对进口燃油的依赖程度，保证国家能源安全。有利于农村地区经济发展，特别是有利于玉米、甘蔗主产区农业的发展和社会的稳定，增加就业机会。生物质转化为酒精的过程生物质转化为酒精的过程一般可分为3部分：将生物质转化为可发酵的原料；生物质降解产物发酵为乙醇；分离提取乙醇及其副产物。具体说，玉米秆等纤维材料经酸水解或水解酶处理后可产糖，加微生物菌种则可发酵生产酒精或虽他产物，经蒸馏、脱水等过程分离提取成为化工产品。第21页，共48页，编辑

24、于2022年，星期六木质纤维素降解利用的三大障碍：第一是木质纤维素材料因具有非常复杂的结构，通常难于被直接降解转化。第二个主要障碍是纤维降解酶的生产效率低、成本较高，影响了酶的广泛使用。第三是半纤维素水解产生的大量戊糖(主要是木糖和少量阿拉伯糖)一般不能被通常的酿酒酵因发酵成酒精。第22页，共48页，编辑于2022年，星期六一、植物纤维原材料的预处理技术一、植物纤维原材料的预处理技术有很多可提高其可降解率的物理、化学预处理方法，如辐射、粉碎、高压热水、有机溶剂、稀酸、低温浓酸、酸催化的蒸汽水解、蒸汽爆破、液氨爆破、碱水解及使用非离子表面活性剂等。另外近年来利用酶（如白腐菌产生的木质素降解酶系）

25、，化学高级氧化法等特异性的降解木质素等组分，从而使纤维素更易降解。1.酸水解和稀酸预处理技术应用新的逆流式流通工艺，可得到很高的纤维素和半纤维素水解程度。同时得糖率高，酸用量少（0.07%）。用稀硫酸在较低温度下处理植物纤维材料，可以只降解其中的半纤维素，而提高经过预处理后的材料中纤维素的可酶解性。因为处理条件较温和，生成的糖类降解比较少。稀酸水解生成的糖类可发酵成乙醇，而处理后的材料可进一步经微生物酶解转化。第23页，共48页，编辑于2022年，星期六酸处理过程中，半纤维素脱出的乙酰基产生的乙酸、糖类降解产生糠醛和5-羟基糠醛和木质素降解的酚类化合物有毒性，对后期的发酵有一定的抑制，解决方法

26、主要有：采用离子交换、过量石灰中和等措施脱毒选育和使用能抗毒性物质的酒精发酵菌使用二氧化硫来代替硫酸进行处理2.蒸汽爆破技术在众多预处理方法中，高压蒸汽爆破技术是比较有效、低成本、无污染的新技术。向装有桓物纤维物质的压力罐中通入高压蒸汽，使罐温达到200-240左右，维持较短时间后，突然减压将物料喷出，使物料爆碎。国内山东大学、南京林业大学等单位都进行过优化蒸汽爆破条件的研究。第24页，共48页，编辑于2022年，星期六原理在高温条件下，原料中的半纤维素会迅速分解释放出有机酸，进而发生自水解作用而可溶化，细胞间的本质素也能出现溶化，并发生部分降解，变得易被热水、有机溶剂或稀碱抽提。加上突然减压

27、爆碎的机械分离作用，植物细胞间质或细胞壁变得疏松，细胞游离，纤维素的可酶解性明显增强。3.低温氨爆处理氨作为碱性物质，能破坏木质素结构。用液氨在低温下处理纤维性材料，并用突然减压的方法产生爆碎效应，可用于增加某些草类和农业残余物的可消化性。通过大量研究工作，此技术取得了一定程度的成功。爆碎后气化的氨比较容易回收，又不太形成发酵抑制物，能量消耗和投资成本也比较合理的，进一步研究可望改进生物质转化工艺，提高其经济可行性。第25页，共48页，编辑于2022年，星期六4.其他脱木质素技术造纸厂的硫酸盐、亚硫酸盐、烧碱法等制浆方法。用二氧化硫气体处理，用甲醇或乙醇加入少量的盐酸、硫酸或磷酸使木质素醇解。

28、用丙酮等有机溶剂抽提木质素。用碱处理，如用氢氧化钠和石灰使用其它的膨胀剂如:氨、磷酸、氯化锌等。目前，大量的预处理研究都是对表面现象的研究，很少探究预处理过程的化学基础。然而，只有深入开展相关的基础研究，搞清反应过程中的复杂因果关系，才能为进一步的开发研究提供研究方向，确定最佳反应条件，并指导预处理技术的规模放大。第26页，共48页，编辑于2022年，星期六二、纤维素酶的生产与纤维素水解二、纤维素酶的生产与纤维素水解酶法水解具有反应条件温和、不生成有毒降解产物、糖得率高、设备投资低等优点。而妨碍木质纤维素资源酶法生物转化技术实用化的主要障碍之一，是纤维素酶的生产效率低、成本较高，影响了纤维素酶

29、的广泛使用。目前1美国加仑(3.78541dm3)乙醇需用纤维素酶的生产费用约为30-50美分，美国近期的研究目标是将纤维素酶成本减少到低于每加仑乙醇5美分，这需要酶的比活性或生产效率增高约10倍。1.纤维案酶高产菌种的筛选和诱变育种细菌:分解纤维素的细菌大多是厌气性的，生长慢，往往产生大量粘液，并且产生的纤维素酶不是胞内酶，就是附着在细胞壁上，不能分泌到培养液中，这增加了提取的困难。然而,由于近年来芽抱杆菌产生的胞外碱性纤维素酶已在洗涤剂工业中得到实际应用，纤维分解细菌仍受到广泛重视。第27页，共48页，编辑于2022年，星期六真菌：目前，用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌。研究得较多的有

30、木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属及漆斑霉属等。其中木霉、青霉产生的纤维素酶活力往往最高，酶组分最全，因而应用也最广泛。曲霉和根霉产生的主要是内切型纤维素酶，多同于纺织、造纸等纤维的表面加工。一般从自然界筛选分离的野生型菌株产酶能力比较低。为了提高纤维素酶的活力，诱变育种是一个有效的途径。木霉是常用的生产菌，因此，诱变工作大多是用木霉进行的。并且获得了纤维素酶活力显著提高的菌株。从国内外研究的效果看来，高能电子、射线、亚硝基盐和紫外线可能是木霉属菌种较有效的诱变因子。第28页，共48页，编辑于2022年，星期六山东大学的研究者改进了抗阻遏突变株的筛选方法，选出的一株纤维素酶高产菌株斜卧青霉斜卧青霉

31、(P.decumbens JU1)，具有明显的抗降解阻遏特性，可在含有大量可溶性糖的培养基上合成纤维素酶。这就为其快速生长和利用含糖废液做培养基提供了可能。中国科学院上海植物生理生态研究所等单位采用多种诱变剂复合处理也得到比较好的结果。2.纤维素酶的生产纤维素酶的生产液体培养；固体培养：固体培养方法包括薄层的曲盘培养、帘子培养和厚层的通风培养。固体培养设备比较简单，易于推广，但容易污染杂菌，温度和湿度不易控制，大规模生产难于稳定。液体深层培养具培养条件容易控制，不易染杂菌，生产效率高。影响纤维素生产的因素碳源：稻草、玉米芯、糠醛渣、纸浆、甘蔗渣、麸皮等。氮源：硫酸铵、尿素、蛋白胨无机盐、微量元

32、素诱导物：纤维素，包括有-1,4糖苷键的葡聚糖和少数寡糖纤维二糖 乳糖 槐糖：是-1,2糖苷键的葡聚二糖表面活性剂及其他促进剂的作用：吐温80；乙酸钠和抗坏血酸钠。第29页，共48页，编辑于2022年，星期六三、乙醇发酵菌株的选育与工程菌的构建三、乙醇发酵菌株的选育与工程菌的构建理想的生物质乙醇发酵菌应能发酵所有生物质来源的糖，具有对木质素单体、乙酸和其他抑制性副产物的良好抗性，并同纤维素完全水解所需的纤维素酶有协同作用。近年来，许多研究机构都开展了利用代谢工程手段，构建高得率、高生产率、宽底物范围、产物专一和耐乙醇和水解抑制物的木糖发酵菌的研究。1.木糖代谢途径和菌株改造策略通常，微生物代谢

33、木糖生成木酮糖有两种途径。细菌一般采用由木糖异构酶催化的一步途径。而酵母菌中发现的通常是涉及木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的两步反应。木酮糖随后被木酮糖激酶(XK)催化磷酸化为5-磷酸木酮糖，并进而通过磷酸戊糖途径和糖酵解(EMP)途径(或在运动发酵单胞菌中为ED途径)，进一步降解。第30页，共48页，编辑于2022年，星期六构建利用木糖和夏他非发酵糖的发酵菌株的两类代谢工程方法：目标：构建能以高得率和高浓度转化生物质为大宗化学品的微生物。能利用所需底物的微生物，如利用木糖的大肠杆菌，利用纤维素的热纤细菌能产生所需产物的微生物，如生产乙醇的酵母，生产乳酸的乳酸菌代谢工程改进产物形成

34、代谢工程改进底物利用天然底物利用策略重组菌底物利用策略第31页，共48页，编辑于2022年，星期六四、发酵工艺的选择四、发酵工艺的选择使用酶水解法生物转化纤维类生物质的过程通常涉及4步生物催化反应：纤维素酶生产、纤维素水解、己糖发纤维素酶生产、纤维素水解、己糖发酵和戊糖发酵酵和戊糖发酵。根据这些生物反应被组合的程度，工艺过程变化很大。水解发酵二段法：用纤维素发酵酒精，如将纤维素先用纤维S素酶糖化再经酵母发酵成酒精的方法，即所谓水解发酵二段法(separate hydrolysis and fermentation，SHF).水解发酵二段法的致命弱点是由于生成的葡萄糖可抑制纤维素酶的作用。对于这

35、一点，产生的葡萄糖可用透析法除去。第32页，共48页，编辑于2022年，星期六同步糖化发酵水解发酵二段法的致命弱点是由于生成的葡萄糖可抑制纤维素酶的作用。随着水解过程中葡萄糖浓度的不断升高，酶解反应很快就因为产物抑制作用而终让了，因此葡萄糖的转化率低。若在加入纤维素酶的同时接种酒精发酵的酵母，可使生成的葡萄糖立即被酵母发酵成酒精，去除了产物抑制，就可以不妨碍纤维素糖化的继续进行，酒精收得量可为二段法的4倍，这就是所谓的同步糖化发酵(Simultaneous saccharification and fermentation，SSF).同步糖化共发酵随着能同时发酵戊糖和己糖的稳定的基因重组菌株的

36、获得，“同步糖化共发酸(Simultaneous saccharification and cofermentation，SSCF)技术也发展起来。在中试条件下，经过稀酸预处理的玉米纤维在总固体物浓度为20%、纤维素酶用量为每克纤维素使用滤纸酶活(FPA)为10U、30、150r/mm、pH5.0条件下，使用普度大学构建的重组酵目LNH-ST菌株进行同步糖化共发酵4d，78.4%的可用葡萄糖和56.1%的可用木糖被转化成乙醇。第33页，共48页，编辑于2022年，星期六统合生物工艺自然界中的某些微生物(如Clostridium、Moniliar、Fusarium、Neurospora等)都具有

37、直接把生物质转化为乙醇的能力。这就为在同一个生物反应器中利用同一种微生物，完成生物质转化为酒精所需的酶制备、酶水解及多种糖类的酒精发酵等全过程，从而简化工艺，降低成本提供了可能。统合生物工艺(consolidated bioprogressing，CBP)，先前被称为直接微生物转化(direct microbial conversion DMC)，将纤维素酶生产、水解和发酵组合在一步里完成。一些兼性好氧的微生物，如尖孢镰刀菌、粗糙脉孢菌，它是纤维素酶高产菌株，也能发酵葡萄糖、木糖和纤维二糖，也能直接转化纤维素成酒精。首先，通过供氧预培养生成菌体和纤维素酶，然后，停比供氧，转入发酵阶段，即可生产

38、酒精。CBP需要的菌株也可以通过代谢途径工程方法构建。像木糖发酵菌株构建一样，CBP代谢工程也可以通过两条途径进行：天然底物利用策略和重组菌底物利用策略。第34页，共48页，编辑于2022年，星期六3.沼气发酵及其综合利用沼气发酵及其综合利用一、沼气发酵的基本原理一、沼气发酵的基本原理人们很早就发现，富含有机物的沼泽地会发酵形成很多可燃性的混合气体，这种混合气体被称为沼气。沼气是无色的，通常含有约60%-70%甲院、30%-40%二氧化碳，及少量氢、氮和硫化氢等其它气体。沼气具有很高的热值，1m3沼气的热值达20000kJ以上。完全燃烧时，可放出23012-27196kJ热量，是很好的气态燃料

39、。各种废弃的有机物，如农作物秸秆、人畜粪便、工业废液废渣、城市垃圾等，都可以用来发酵生产沼气，为人类提供了消除环境污染、生产可再生能源的重要途径，具有很大的发展潜力。第35页，共48页，编辑于2022年，星期六微生物降解有机物发酵形成甲烷的过程可以分成两个或三个阶段。聚合物降解阶段聚合物降解阶段：大分子高聚物可溶性小分子梭菌属拟杆菌属葡萄球菌属芽孢杆菌属第36页，共48页，编辑于2022年，星期六产酸阶段产酸阶段：小分子糖类挥发性有机酸（乙酸、乳酸、丙酸）链球菌属乳杆菌属梭菌属pH乙酸、氢和二氧化碳产氢产乙酸细菌互营杆菌属互营单胞菌属5.0-6.0第37页，共48页，编辑于2022年，星期六甲

40、烷形成阶段：甲烷形成阶段：有机酸(主要是乙酸)甲烷和二氧化碳pH7.2-7.4甲烷杆菌属甲烷八叠球菌属甲烷球菌属第38页，共48页，编辑于2022年，星期六（2）辅酶 M（CoM，CoM-SH）CoM 是所有已知辅酶中最小的具有渗透性、含量最高、对酸和热稳定的辅助因子。在 260nm 处呈现最大吸收峰。CoM 在产甲烷细菌细胞内的含量很高，平均浓度可达 0.22mmol/L。是一种甲基转移酶的辅酶，即为活性甲基的载体。另外还有参与 C1 的还原反应的甲基蝶呤（Methanopterin，MPT），其结构与叶酸相似，作用功能也与其相同。在产甲烷和产乙酸过程中起甲基载体作用的 CO2还原因子（Ca

41、rbon dioxide reducing factor，CDR）也即甲烷呋喃（Methanofuran，MFR）。另一个 F430，是存在于嗜热自养甲烷杆菌中含 Ni 的四吡咯结构，是甲基辅酶 M 还原酶组分C的弥补基，参与甲烷形成的末端反应。第39页，共48页，编辑于2022年，星期六沼气发酵工艺沼气发酵工艺沼气发酵工艺分类按照投料方式分按照投料方式分连续投料发酵（养殖场）半连续发酵工艺（农户）批量发酵工艺（农户小型）按发酵级差划分按发酵级差划分 单级沼气发酵工艺 多级沼气发酵工艺以发酵温度划分以发酵温度划分 高温发酵工艺（5060）中温发酵工艺（35+-2）常温发酵工艺 以发酵阶段划分以

42、发酵阶段划分 单相发酵工艺（农村，一锅煮）两相发酵工艺（工业级）影响沼气发酵的条件影响沼气发酵的条件厌氧环境 发酵原料发酵温度 酸度接种物 添加剂和抑制物搅拌第40页，共48页，编辑于2022年，星期六沼气发酵工艺流程：选取（培育）菌种备料、进料池内堆沤（调整pH值和浓度）密封（启动运转）放气试火日常管理（进出料、回流搅拌）。三、沼气发酵产物及其综合利用三、沼气发酵产物及其综合利用沼液沼液浸种（供应营养、消毒）沼液叶面施肥或灌溉沼液防治病虫害养蘑菇 喂猪 防果苗冻害 养鱼 沼渣利用养殖蘑菇种花农作物基肥第41页，共48页，编辑于2022年，星期六微生物燃料电池（微生物燃料电池（MFC）开发MF

43、C的背景能源危机 环境污染污水处理 固体有机废弃物特殊应用领域（航天、探险等）研究历史1911年英国植物学家Potter用酵母和大肠杆菌进行试验，宣布利用微生物可以产生电流。1984 年，美国科学家设计出一种用于太空飞船的细菌电池，其电极的活性物来自宇航员的尿液和活细菌，但当时的细菌电池发电效率较低。20世纪90年代初，燃料电池开开始受到关注。1999年人们发现不添加中介体的MFC也能产电，从而在MFC领域取得了重大突破。微生物燃料电池利用领域及其优越性燃料来源多样 操作条件温和 无污染，可实现零排放 无需能量输入 能量利用的高效性 生物相容性第42页，共48页，编辑于2022年，星期六微生物

44、电池的分类和原理微生物电池的分类和原理按电子转移方式的不同，微生物燃料电池又可分为直接微生物燃料电池和间接微生物燃料电池。直接微生物燃料电池是指燃料直接在电极上被氧化，电子直接由燃料转移到电极。间接微生物燃料电池的燃料不在电极上氧化，而是在别处氧化后，电子通过某种途径传递到电极上来。其中的氧化还原介体成为电子传递的关键环节，充当介体应具备如下条件：容易通过细胞壁；容易从细胞膜上的电子受体获取电子；电极反应快；溶解度、稳定性等要好；对微生物无毒；不能成为微生物的食料。一些有机物和金属有机物可以用作微生物燃料电池的氧化还原介体，其中，较为典型的是硫堇、Fe（）EDTA 和中性红等间接生物电池的弊端

45、易被细胞膜吸附有损耗，价格昂贵大部分介质有毒第43页，共48页，编辑于2022年，星期六直接微生物燃料电池腐败希瓦菌（Shewanella putrefaciens）燃料电池，一种还原铁细菌，在提供乳酸盐或氢之后，无需氧化还原介质就能产生电。Geobacteraceae sulferreducens 燃料电池：还原Fe3+Rhodoferax ferrireducens 燃料电池直接微生物燃料电池的发展方向宽底物适应的微生物。电池单室化有利于电池的放大。阴极和阳极材料的优化提高质子交换膜的质子通透性纳米技术用于电极制造。扩大阳极的面积直接微生物燃料电池的应用前景生物修复废水处理生物传感器第44

46、页，共48页，编辑于2022年，星期六MFC的工作机制的工作机制MFC产生电流的过程(1)底物生物氧化(2)阳极还原 (3)外电路电子传输 (4)质子迁移 (5)阴极反应底物生物氧化：底物生物氧化：产电呼吸代谢：微生物对Fe等金属氧化物作为电子受体的依赖推动微生物放电进化。高氧化还原代谢中氧化还原代谢发酵第45页，共48页，编辑于2022年，星期六阳极微生物大多数微生物产生的电子不能够传出体外,不具有直接的电化学活性。然而,许多微生物通过添加某些可溶性氧化还原介体作为电子传递中间体,可以将电子由胞内传递至阳极表面。少数微生物以位于细胞膜上的细胞色素或自身分泌的醌类作为电子载体将电子由胞内传递至

47、电极上。阳极还原纳米导线细胞表面电子传递中介体（绿浓菌素）初级代谢产物原位氧化传递第46页，共48页，编辑于2022年，星期六生物膜产电机制生物膜产电机制,即微生物在电极表面聚集,形成生物膜,达到直接接触或利用纳米导线辅助转移电子的目的,是一种无介体电子传递。无介体电子传递过程与阳极表面体接触的产电微生物菌体,可通过细胞膜外侧的 C 型细 胞色素将呼吸链中电子直接传递至 电极 表面。纳米导线一端与细胞外膜相连,另一端与电极表面直接接触,从而使细胞外膜上的电子传递至电极表面,实现电子转移。电子穿梭产电机制电子穿梭产电机制,即微生物利用外加或自身分泌的电子穿梭体(氧化还原介体),将代谢产生的电子转

48、移至电极表面。还原态初级代谢产物原位氧化传递还原态初级代谢产物原位氧化传递：另有一些微生物能以代谢过程中产生的如 H2、H2 S 等可氧化还原态代谢产物(初级代谢产物)作为氧化还原介体,进行电子传递,第47页，共48页，编辑于2022年，星期六外电路电子传输外电路电子传输转移至阳极的电子经由外电路传输至阴极,表现出电流和电压的 输出。质子迁移质子迁移底物被氧化产生电子的同时产生质子,质子在MF C 中向阴 极室迁移。此过程 直接影响电池 的内阻,是限制 MF C 用于实际的关键步骤之一。影响质子传递的因素底物和电解液的离子浓度、质子交换膜 的内阻、MF C 的构造 研究发现,高浓度的缓冲液可 以在某种程度上减弱质 子交换的限制,同时增加电解液的离子浓 度可 以 提高能量输出Nafion 膜研究最多,它是一种全氟磺酸质子交换膜,具有较高的离子传导性。盐桥的方式来替代交换膜无膜反应器第48页，共48页，编辑于2022年，星期六