微生物菌种保藏原理与方法幻灯片.ppt

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1、微生物菌种保藏原理与方法第1页，共15页，编辑于2022年，星期六菌种保藏基本原则o保藏菌种时首先要选择它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等，并创造一个低温、干燥、缺氧、避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能较长时间维持其休眠状态。o对于不产孢子的微生物，也要使其新陈代谢处于最低水平，又不会死亡，从而达到长期保藏的目的。第2页，共15页，编辑于2022年，星期六常用菌种保藏方法o1 常用的简易保藏法：o斜面传代保藏法、半固体穿刺保藏法（适用于细菌和酵母菌）、石蜡油封法o2 甘油保藏法o3 干燥保藏法o4 真空冷冻干燥保藏法o5 液氮超低温保藏法第3页，共15页，编辑于2022年，星期六1 简易保

2、藏法o基本原理：利用低温来抑制微生物生命活动。o通常将在斜面或半固体培养基上生长良好时培养物直接放到210 冰箱中保藏，当培养基营养物质消耗殆尽后再重新移植到新的 培养基上，故又称定期移植保藏法或传代培养保藏法。第4页，共15页，编辑于2022年，星期六1 简易保藏法o定期移植时间间隔：o一般不产芽孢的细菌约2周至1个月；o放线菌、酵母菌和丝状真菌46个月；o石蜡油封法一般可保藏1年。o优缺点：操作简单，可随时观察菌种生长状况，但较费时费力，因经常移植传代，微生物物易发生变异。第5页，共15页，编辑于2022年，星期六1.1斜面传代保藏法o贴标签：菌种 菌株 接种日期o接种：对数生长期后期 成

3、熟的孢子o培养：细菌37，1824h 酵母2830 ，3660h 放线菌和丝状真菌28 ，47do收藏：管口面塞用牛皮纸包扎，或用融化的固体石蜡封棉塞后置4冰箱保存。第6页，共15页，编辑于2022年，星期六1.2半固体穿刺保藏法o贴标签o穿刺接种：将菌种直刺入直立柱中央o培养：同传代保藏法o收藏：待菌长好后，用浸有石蜡的无菌软木塞或橡皮塞代替面塞并塞紧，置4 冰箱中保藏，保藏0.51年。第7页，共15页，编辑于2022年，星期六1.3石蜡油封法o石蜡油灭菌：将石蜡油装入三角瓶中，装量不超过总体积的1/3，塞上面塞，外包牛皮纸，加压蒸汽灭菌（121 ，30min），连续灭菌2次。然后在40 温

4、箱中放置2周或置105110 烘箱中烘2h，除去石蜡油中的水分。o培养o加石蜡油：以无菌吸管吸石蜡油加至菌种管中，加入量以高出斜面顶端或直立柱培养基表面约1cm为宜。o收藏：面塞外包牛皮纸或用无菌橡皮塞，把菌种管直立放置于4 冰箱中。o放线菌、霉菌及产芽孢细菌一般可保2年，酵母菌及不产芽孢细菌可保1年。第8页，共15页，编辑于2022年，星期六2 甘油保藏法o保护剂：40%左右的甘油o机理：适当浓度甘油中，少量甘油分子进入细胞，使菌种细胞在冷冻过程中缓解了其由于强烈脱水及胞内形成冰晶而引起的破坏。o保藏温度：-20 左右或-70 o特点:操作简单，保藏期长，保存期间取样测试方便，在基因工程中常

5、用于保存含质粒的菌株，一般可保35年。第9页，共15页，编辑于2022年，星期六2 甘油保藏法o方法步骤：o无菌甘油的制备：80%的甘油在121灭菌20mino保藏培养物的制备：活化 纯化 性能检测 制备菌种培养物o保藏菌悬液的制备：液体法 菌苔法 -20 保藏o快速冷冻；乙醇-干冰 液氮o超低温保藏：-70 一般细菌、酵母保存期为35年。第10页，共15页，编辑于2022年，星期六3 干燥保藏法o基本原理：将微生物赖以生存的水分蒸发掉，使细胞处于休眠和代谢停滞状态，从而达到较长期保藏的目的。低温条件下，保藏期可达数年至十几年之久。o砂土管保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、麸皮保藏法第11页，

6、共15页，编辑于2022年，星期六o砂土管保藏法产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌。o方法：处理砂土 装沙土管 制备菌液 加孢子液 干燥 收藏 恢复培养o明胶片保藏法细菌o制备菌悬液 制备菌液 制备蜡纸 加菌液 干燥 收藏 恢复培养3干燥保藏法第12页，共15页，编辑于2022年，星期六o硅胶保藏法丝状真菌。o方法：制备硅胶 制备菌液 加菌液 干燥 收藏 恢复培养o麸皮保藏法产孢子的丝状真菌。o制备麸皮培养基 培养菌种 干燥 收藏 恢复培养3干燥保藏法第13页，共15页，编辑于2022年，星期六4冷冻真空干燥保藏法o该法集中了菌种保藏中低温、缺氧、干燥和添加保护剂等多种有利条件，是微生物代谢处于相对静止状态。o该法可同时用于细菌、放线菌、丝状真菌、（除少数不产孢子或只产生丝状体真菌外）、酵母菌及病毒的保藏。o该方法保藏菌种范围广、保藏时间长（一般可达1020年），存活率高，是目前最有效的菌种保藏方法之一。第14页，共15页，编辑于2022年，星期六4冷冻真空干燥保藏法安瓿管第15页，共15页，编辑于2022年，星期六