第5十四章基因重组和基因工程.pptx

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1、DNA克隆、测序与重组技术的历史1973年，年，Stanley Cohen等人首次获得体等人首次获得体外重组外重组DNA的分子克隆的分子克隆1977年，年，Allan Maxam和和Walter Gilbert的化学裂解的化学裂解DNA测序问世测序问世不久，不久，Sanger 等的双脱氧测序法等的双脱氧测序法20世纪世纪90年代启动人类基因组计划年代启动人类基因组计划(human genome project，HGP)重组重组DNA技术学技术学(Recombinant DNA Technology)第1页/共99页第一节第一节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移是经常发生的是经常发生

2、的 DNA Recombination and Gene Transfer Occur Frequently in Nature第2页/共99页DNA重组接合作用接合作用(conjugation)转化作用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transduction)转转 座座(transposition)同源重组同源重组(homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)第3页/共99页发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同源源重重组组(homologous recom

3、bination)，又又称称基基本本重重组组（general recombination）。是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行行单单链或双链片段的交换。链或双链片段的交换。以以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。模型。一、同源重组是最基本的DNA重组方式第4页/共99页nHolliday模型的4个关键步骤：两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐；排列整齐；片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体

4、拼接重组体(splice recombinant)一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成对应的链连接，形成Holliday中间体；中间体；通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA；Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：，分别为：第5页/共99页片段重组体片段重组体（见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本两侧来自同一亲本DNA。拼

5、接重组体拼接重组体（见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。第6页/共99页 内切酶内切酶(recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA)内切酶内切酶(recBCD)DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holiday中间体中间体53535353第7页/共99页Holiday中间体中间体5353535355355333355553333555533355553333555533

6、33内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片片段段重重组组体体拼拼接接重重组组体体第8页/共99页二、细菌的基因转移与重组有四种方式（一）接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌）的的DNA转转移移称称为为接接合合作用作用(conjugation)。第9页/共99页可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。分子。质粒质粒第10页/共99页（二

7、）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称称为为转转化化作作用用(transformation)。第11页/共99页例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。第12页/共99页（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因重组即为因重组即为转导作用转导作用(transduct

8、ion)。第13页/共99页噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)第14页/共99页三、位点特异重组，即特异位点间三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合发生的整合位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两是由整合酶催化，在两个个DNA序列的特异位点间发生的整合。序列的特异位点间发生的整合。第15页/共99页噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色色体体的的特特异异靶靶位位点点发发生生选选择择性性整整

9、合合；反反转转录录病病毒毒整整合合酶酶可可特特异异地地识识别别、整整合合反反转转录录病病毒毒cDNA的的长末端重复序列长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)。（一）噬菌体DNA的整合第16页/共99页（二）细菌的特异位点重组沙门菌沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。第17页/共99页hix为为反反向向重重复复序序列列，它它们们之之间间的的H片片段段可可在在Hin控控制制下下进进行行特特异异位位点点重重组组(倒倒位位)。H片片段段上上有有两两个个启启动动子子P，其其一一驱驱动动hin基基因因表表达达，另另一一正正向向时时驱驱动动H2和和rH1基基因

10、因表表达达，反反向向(倒倒位位)时时H2和和rH1不表达。不表达。rH1为为H1的阻遏蛋白基因。的阻遏蛋白基因。第18页/共99页 H2鞭毛素鞭毛素 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶转位片段转位片段hinH2IH1 H1鞭毛素鞭毛素hinH2IDNA启动序列启动序列H1启动序列启动序列沙门菌沙门菌H H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变第19页/共99页（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免免疫疫球球蛋蛋白白(Ig)，由由两两条条轻轻链链(L链链)和和两两条条重重链链(H链链)组组成成，分分别别由由三三个个独立的基因族编码，其中两个编码轻链独立的基因族编码，其中两个

11、编码轻链(和和)，一个编码重链。，一个编码重链。轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 第20页/共99页重重链链(IgH)基基因因的的V-D-J重重排排和和轻轻链链(IgL)基基因因的的V-J重重排排均均发发生生在在特特异异位位点点上上。在在V片片段段的的下下游游，J片片段段的的上上游游以以及及D片片段段的的两两侧侧均均存存在在保保守守的的重重组组信信号号序序列列(recombination signal sequence,RSS)。此此重重排排的的重重组组酶酶基基因因rag(recombination activating gen

12、e)共共有有两两个个，分分别别产产生蛋白质生蛋白质RAG1和和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCAC TGTTTTTGG重组信号序列基因片段第21页/共99页V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免免疫疫球球蛋蛋白白基基因因重重排排过过程程第22页/共99页四、转座重组由由 插插 入入 序序 列列 和和 转转 座座 子子 介介 导导 的的 基基 因因 移移 位位 或或 重重 排排 称称 为为 转转 座座(transpositi

13、on)。大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和序列包括插入序列和转座子。转座子。第23页/共99页 插入序列插入序列(insertion sequences,IS)组成：组成：IRTransposase GeneIR（一）插入序列转座二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats,IR)序列序列特有的正向重复序列特有的正向重复序列一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因第24页/共99页

14、插入序列发生转座的形式：插入序列发生转座的形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)第25页/共99页插插入入序序列列的的复复制制性性转转座座第26页/共99页转座子转座子(transposons)可从一个染色体位点转移到另一位点的可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。分散重复序列。IRIRTransposase Gene有用基因有用基因（二）转座子转座转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因

15、第27页/共99页 细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L第28页/共99页由转座子介导的转座由转座子介导的转座第29页/共99页第二节第二节 重组重组DNA技术技术又称又称DNA克隆或分子克隆克隆或分子克隆 DNA Recombination Technique is a

16、lso Called DNA Cloning or Molecular Clone 第30页/共99页重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。的豌豆杂交试验。1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。的肺炎球菌转化实验。1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。分子。1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的技术制造医学上重要的药物。药物。1980年

17、年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。技术生产胰岛素的工厂。1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。英国罗林研究所成功的克隆了多莉。第31页/共99页相关概念相关概念 DNA克隆克隆 工具酶工具酶 目的基因目的基因 基因载体基因载体基本原理基本原理 重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要内容：本节主要内容：第32页/共99页一、重组DNA技术相关概念克隆克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。，即

18、无性繁殖。（一）DNA克隆第33页/共99页技术水平：技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)（即（即DNA 克隆）克隆）细胞克隆细胞克隆 个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）第34页/共99页应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质（同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA）与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的

19、的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分子，也称分子，也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。DNA克隆克隆第35页/共99页生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等 目的：目的：分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基因克隆所用的方法及相关实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称

20、重组的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。工艺学。第36页/共99页（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶第37页/共99页重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段

21、连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多

22、聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基第38页/共99页限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序列序列,并在识别位点或其周围切割双链并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定义：第39页/共99页与与

23、甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA，保护自身，保护自身DNA。、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）分类：作用：第40页/共99页第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种

24、酶第41页/共99页类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG第42页/共99页Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口第43页/共99页来来源源不不同同的的限限制制酶酶，但但能能识识别别和和切切割割同同一一位位点点，这这些些酶酶称称同同功异源酶功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAG

25、GATCC G+Bst同功异源酶：第44页/共99页有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍伍未端未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg l l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶第45页/共99页名称名称 识别序列及切割位点识别序列及切割位点名称识别序列及切割点名称识别序列及切割点切割后产生切割后产生突出

26、末端突出末端:BamH 5GGATCC.3GATCC.3Bgl 5AGATCT.3GATCT.3EcoR EcoR 5GAATTC.3AATTC.3Hind Hind 5AAGCTT.3AGCTT.3 Hpa Hpa 5CCGG.3CGG.3 Mbo Mbo 5GATC.3GATC.3 Nde Nde 5GATATG.3TATG.3切割后产生切割后产生3突出末端突出末端:Apa 5GGGCCC.3C.3Hae 5PuGCGCPy.3Py.3Kpn 5GGTACC.3C.3Pst 5CTGCAG.3G.3Sph 5GCATGC.3C.3切割后产生平末端切割后产生平末端:Alu 5AGCT.3CT

27、.3EcoR 5GATATC.3ATC.3Hae Hae 5GGCC.3CC.3Pvu Pvu 5CAGCTG.3CTG.3Sma Sma 5CCCGGG.3GGG.3 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶第46页/共99页（三）目的基因(target gene)cDNA(complementary DNA)指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA(通常指通常指mRNA或病毒或病毒RNA)互补的单链互补的单链DNA。以单链以单链cDNA为模板、经聚合反应可合为模板、经聚合反应可合成双链成双链cDNA。基因组基因组DNA(genomic DNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞

28、或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体染色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。第47页/共99页（四）基因载体 定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA第48页/共99页克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设设计计的的载载体体称称为为克克隆隆载载体体。表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可

29、转录翻译成序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的多肽链而特意设计的载体称为载体称为表达载体表达载体。第49页/共99页n载体的选择标准：载体的选择标准：能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。第50页/共99页1.1.质粒质粒(plasmid)特特点点:能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某

30、些些遗遗传传信信息息,会会赋赋予予宿宿主主细细胞胞一一些遗传性状。些遗传性状。第51页/共99页第52页/共99页第53页/共99页 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列 pUC系列系列第54页/共99页粘性质粒(cosmid)第55页/共99页 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工

31、染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）4.其他第56页/共99页二、重组DNA技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体细胞导入受体细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 第57页/共99页 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程第58页/共99页（一）目的基

32、因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)(见第见第22章章)第59页/共99页化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。序列。第60页/共99页组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制

33、性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内由克隆载存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组体所携带的所有基因组DNA的集合的集合从基因组从基因组DNA文库获取目的文库获取目的基因基因第61页/共99页限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 K

34、b 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 第62页/共99页mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制 从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T第63页/共99页（二）克隆载体的选择和构建目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。法也不同。第64页/共99页（三）外

35、源基因与载体的连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接1.粘性末端连接第65页/共99页Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接第66页/共99页不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco R切割位点切割

36、位点Bg l切割位点切割位点+EcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的连接情配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连况和同一限制酶切位点连接相似。接相似。第67页/共99页2.平端连接平端连接 限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端适用于：适用于：第68页/共99页目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连第69页/共99页在在末末端端转转移移酶酶(

37、terminal transferase)的的作作用用下下，在在DNA片片段段末末端端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。3.同聚物加尾连接第70页/共99页5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3 353 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体5第71页/

38、共99页由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接而进行粘端连接。4.人工接头(linker)连接第72页/共99页人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R第73页/共99页受体菌条件：受体菌条件：安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)导入方式：导入方式：转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（四）重组DNA导入受

39、体菌第74页/共99页1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选第75页/共99页(插插入入失失活活法法)抗抗药药性性标标记记选选择择第76页/共99页 互补利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18 第77页/共99页 原原位位杂杂交交第78页/共99页 Southern印迹印迹第79页/共99页鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫

40、学方法免疫学方法 第80页/共99页重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为：技术操作过程可形象归纳为：小结小结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体细胞转入受体细胞筛筛筛选重组体筛选重组体 第81页/共99页重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重

41、组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交第82页/共99页表达体系的建立：表达体系的建立：表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的建立受体细胞的建立 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达第83页/共99页 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusio

42、n body)；很难表达大量可溶性蛋白。很难表达大量可溶性蛋白。1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用)第84页/共99页大鼠胰岛素原大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌的表达和分泌第85页/共99页第86页/共99页 优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累 缺点：缺点：操作技术难、费时、经济操作技术难、费时、经济 转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 电穿孔电穿孔 脂质体

43、转染脂质体转染 显微注射显微注射 2.2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）第87页/共99页表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱第88页/共99页表达载体表达载体YEpI PT的物理图谱的物理图谱第89页/共99页第三节第三节 重组重组DNA技术与医学技术与医学的关系非常密切并前景远大的关系非常密切并前景远大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective第90页/共99页一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子

44、机制。根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。疾病基因发现的两个典型例子疾病基因发现的两个典型例子:脆性脆性X综合征综合征Kallmann综合征综合征第91页/共99页二、生物制药利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为项重大产业，并将有望成为2121世纪的支柱产业。世纪的支柱产业。美国美国Eli Lilly公司于公司于19821982年首先利用重组年首先利用重组DNADNA技术合成人胰岛素并投技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有放市场，标志

45、着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有5050多种基多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。第92页/共99页 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞

46、生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱第93页/共99页基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学

47、学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的置换、缺失或插入等突变。的置换、缺失或插入等突变。又称又称DNA诊断诊断。三、基因诊断与治疗（一）基因诊断的概念第94页/共99页基本过程：区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断第95页/共99页能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。标准：第96页/共99页（二）基因治疗的概念定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)第97页/共99页1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性四、遗传疾病的预防第98页/共99页感谢您的观看！第99页/共99页