色谱分析法导论3.pptx

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1、一、色谱分析概论一、色谱分析概论问题问题问题1：什么是色谱法？问题2：为什么色谱法能将混合物分开？问题3：色谱法的分类？问题4：各种色谱法的应用范围？第1页/共87页1、什么是色谱法？、什么是色谱法？茨维特的实验茨维特的实验茨维特：俄国植物学家，主要从事植物色素的研究工作，在1906 年发表的文章中，首次提出了色谱的概念。第2页/共87页茨维特的实验第3页/共87页因此色谱法是一种分离方法。它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。Chromatography将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。色谱分析是一种分离、分析法。第4页/共87页 2、色谱法分离原理、色谱法分离原理当

2、流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。第5页/共87页3、色谱法的分类、色谱法的分类 按流动相状态的不同，可分为气相色谱法(GC)液相色谱法(LC)超临界流体色谱(SFC)第6页/共87页什么是气相色谱法？以气体为流动相的色谱法Gas Chromatogaphy，简称GC按固定相状态的不同可分为：气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)适合分离分析易汽化（在-190-500范围内有0.2-10mmH

3、g的蒸气压的）稳定、不易分解、不易反应的样品，特别适合用于同系物、同分异构体的分离。第7页/共87页什么是液相色谱法？以液体为流动相的色谱法Liquid Chromatogaphy，简称LC适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。第8页/共87页应用举例(HPLC)第9页/共87页按固定相使用的形式可分为柱色谱（Column Chromatography）将固定相装在色谱柱内纸色谱（Paper Chromatography）用滤纸做固定相或固定相载体的色谱薄层色谱（Thin Lay Chromatography）固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上 第10页/共87页n 关于分配平衡p分配系数K

4、(distribution coefficient)p分配比k又称为容量因子、容量比、分配容量，是指在一定温度和压力下，平衡状态时组分在固定相中的量与在流动相中的量之比值。是衡量柱子对组分保留能力的重要参数。第11页/共87页p相比 色谱柱内固定相和流动相体积之比 是柱型及结构的重要特征。第12页/共87页4.色谱相关术语关于色谱峰关于保留值关于分配平衡第13页/共87页n 关于色谱峰的术语峰峰高基线峰宽半峰宽峰面积标准偏差第14页/共87页色谱峰宽（区域宽度）峰底宽 Wb 在色谱峰两边的转折点所画的切线 与基线相交的截距。标准偏差 拐点间距离的一半 0.607h 半峰宽度 峰高一半处的峰宽度

5、 W 1/2=2.354 峰底宽 Wb=4 拐点处峰宽 W=2 第15页/共87页（4 4）色谱图的信息 a.色谱峰个数 判断试样中所含组分的最少数判断试样中所含组分的最少数 b.色谱保留值 定性定性 c.色谱峰面积或峰高 定量定量 A A=K CK C d.保留值与区域宽度 评价柱分离效能依据评价柱分离效能依据 e.两峰间距 评价两组分能否分离评价两组分能否分离 第16页/共87页n 关于保留值的术语p死时间(tM):):无保留组分出峰时间p保留时间(tR):):从进样开始到色谱峰最大值出现所需时间p调整保留时间(tR):):p死体积(VM):):p保留体积(VR):):p调整保留体积(VR

6、):):p相对保留值：第17页/共87页二、色谱分析法基本理论二、色谱分析法基本理论研究理论的目的解决色谱峰的分离问题三个色谱基本理论问题色谱热力学问题发展高选择性色谱柱色谱动力学问题发展高效能色谱柱分离条件的最优化问题分离条件优化第18页/共87页1、色谱动力学理论、色谱动力学理论 研究流出曲线展宽的本质及曲线形状变化的影响因素塔板理论速率理论第19页/共87页（1）塔板理论）塔板理论推导 塔板理论将色谱柱比作精馏塔，通过概率理论得到流出曲线方程：为标准偏差第20页/共87页当t=tR时，C=Cmax，峰高正比于进样量C0，是峰高定量的理论基础。当n越大，柱效越大，Cmax/C0越大。即保留

7、时间一定时，塔板数越多，峰越高。Cmax反比于tR，tR小，Cmax大，保留时间小的组分峰高且窄。tR大，Cmax小，保留时间大的组分峰低且宽。n 对色谱流出曲线方程的讨论第21页/共87页n 柱效 由流出曲线方程导出：H=L/nn是峰相对展宽的量度n是柱效的量度n是常数时，W与tR 成正比n越大，H越小，表明组分在柱中达到的分配平衡次数越多，对分离越有利，但还不能预言各组分有被分离的可能性。第22页/共87页n 塔板理论的贡献塔板理论有助于我们形象的理解色谱的分离过程。导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现象相吻合。导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标。第23页/共87页n

8、塔板理论的局限塔板高度H是一个抽象的物理量，它的色谱本质是什么？它与哪些参变量有关，又怎样影响峰的扩张？对实验的指导意义有限。不能解释流速对理论塔板数的影响。有些假设不合理，如没有考虑纵向扩散对色谱分离的影响等。第24页/共87页（2 2）速率理论）速率理论概述概述速率理论是1956年荷兰学者Van Deemter等提出，因此又称作范第姆特方程。运用流体分子规律研究色谱过程中产生色谱峰扩展的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关系，揭示了影响塔板高度的动力学因素。第25页/共87页n 气相色谱气相色谱中速率方程的导出速率方程的导出速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影响塔板数n的因素，也就是

9、影响塔板高度H的因素。H=A+B/u+Cu第26页/共87页涡流扩散项A=2dp涡流扩散项均匀性因子粒径第27页/共87页 涡流扩散项A 由不等路径造成的色谱峰扩展。由于柱填料粒径大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。第28页/共87页分子扩散项B/u项其中B=2Dg弯曲因子扩散系数第29页/共87页 分子扩散项 由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞子的形式存在于色

10、谱柱的很小一段空间中，由于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。第30页/共87页传质阻力项由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成第31页/共87页 气相传质阻力项C Cg g u u 试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子随流动相向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。容量因子第32页/共87页 液相传质阻力项CL u u 试样组分从固定相表面移动到固定相内部再回到表面的过程中，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分子有滞留倾向。在此过程中，部分组分分子先离开固定

11、相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。液相扩散系数液膜厚度第33页/共87页气相色谱中的速率方程第34页/共87页n 速率方程给我们的什么启示速率方程给我们的什么启示？为柱型的研究和发展提供理论依据为操作条件的选择提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导第35页/共87页对柱型研究和发展的影响（1）A=0?Golay1957年提出毛细管柱的概念（opentube）毛细管柱A=0，H=B/u+CuH，N，分离能力大大提高第36页/共87页对柱型研究和发展的影响（2）B=0?溶质在液体中的扩散系数DL10-5cm2/s溶质在气体中的扩散系数Dg10-1cm2/sDL Dg当采用液体作流动相时 B0液

12、体作流动相时可用更细的固定相，A HPLC柱效比GC要高23个数量级第37页/共87页操作条件对柱效的影响（1）H-u H-u 曲线曲线第38页/共87页载气线速度（流速）的影响最佳流速：u=(B/C)1/2实用最佳流速：比最佳流速更快A与流速无关B/u：当流速小时，对H的大小起主导作用Cu：当流速大时，对H的大小起主导作用第39页/共87页容量因子容量因子k k的影响的影响不同组分k不同，测出的柱效不同在气相传质阻力相中，k，Cg 理论上说k越小柱效越高，实际不可取在液相传质阻力相中，k ，Cl先，后当k=1时，最大。希望k在一个合适的范围内，通过改变柱温、固定相、柱型参数等可实现。第40页

13、/共87页柱温的影响间接影响、十分复杂对k影响，对扩散系数影响，从而对柱效产生影响，但影响情况难以判断第41页/共87页对色谱柱的填充提供理论指导（1）柱径：柱径越小，固定相越难填充均匀。柱长L：柱长增加，总塔板数增加，但分离时间将增加。固定相粒径dp：根据速率方程，粒径减小，A项减小，C项减小，柱效增加。但粒径太小，不易填充均匀，A项又增大。第42页/共87页对色谱柱的填充提供理论指导（2）液膜厚度df：从柱效角度考虑，液膜越薄，柱效越高（根据速率方程），但允许的进样量减小。第43页/共87页（1 1）几个概念几个概念选择性系数选择性系数定义与相对保留值(ri,s)基本相同不同之处在于选择性

14、系数是两个相邻峰的调整保留值之比（后峰比前峰，1），而不是被测物与标准物质的调整保留值之比（可小于1）它是评价固定液选择性的指标。选择性系数越大，该柱对此相邻峰的分离越好。第44页/共87页几个概念几个概念有效塔板数有效塔板数N N有效有效在气相色谱中，通常用有效塔板数N N有效和有效塔板高度H有效来评价柱子的分离效能，它扣除了死体积对分离的影响，更好地反映了柱子的实际分离效能。柱效越高，该柱的分离能力越好。第45页/共87页几个概念几个概念分离度分离度R Rn n R R越大，说明两组分分离得越好。越大，说明两组分分离得越好。n n 由于该定义综合了色谱动力学和热力学因素，可作为色由于该定义

15、综合了色谱动力学和热力学因素，可作为色谱柱的总分离效能指标。谱柱的总分离效能指标。第46页/共87页(2)(2)色谱分离基本方程（色谱分离基本方程（PurnellPurnell方程）方程）n 公式推导第47页/共87页（3 3）色谱分离基本方程的启示）色谱分离基本方程的启示要改善物质对的分离（提高R），即提高两相邻物质的分离度，可以采取以下措施：提高柱效N提高选择性系数增大容量因子k第48页/共87页N N的影响，如何提高N N？分离度R与理论塔板数N的平方根成正比关系，增加塔板数，有利于提高分离度。增加柱长可增加N，改善分离，但分析时间将大大延长，峰产生扩展。减小塔板高度H：根据速率方程的启

16、示制备一根性能优良的色谱柱是十分重要的。根据速率方程选择合适的色谱条件同样有效。第49页/共87页K K的影响，如何改变k k？分离度与容量因子有关，容量因子越大，分离越好。k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00但当容量因子大于10，k/(k+1)的改变不大，而分析 时 间 将 大 大 延 长。因 此，k的 最 佳 范 围 是1k10。第50页/共87页改变容量因子的方法有：改变柱温改变相比，即改变固定相的量和改变柱死体积，其中死体积对k/(k+1)的影响很大，使用死体积大的柱子，分离度将受到很大损失。在高

17、效液相色谱中改变流动相的配比是最简便、最有效的方法第51页/共87页的影响，如何改变？N有效R=1.0R=1.51.001.0051.011.021.051.101.251.502.00650000163000420007100190040014065145000036700094000160004400900320145第52页/共87页相对保留值（选择性因子）越大，分离效果越好。增大是提高分离度最有效的手段。改变柱温也可改变。在气相色谱中，增大最有效的手段是改变固定相，选择合适的固定相种类是解决分离问题的关键在高效液相色谱中，流动相的种类和配比是改善分离最简便有效的方法。第53页/共87页

18、（4 4）分离度究竟要多大？）分离度究竟要多大？一般来说R应大于1.5。具体工作中应根据样品要求和定量方法来确定。例如：含量50%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2=1.28，而采用峰面积定量R1/2需1.00。含量1%的组分，要使峰高定量误差小于1%，需达到R1/2=1.83，而采用峰面积定量R1/2需2.37。第54页/共87页3.气相色谱操作条件的选择气相色谱操作条件的选择流速柱温气化温度检测器温度进样量载气种类固定相种类第55页/共87页流速u u（FcFc）根据速率方程，可计算求出最佳流速，此时柱效最高。在实际工作中，为缩短分析时间，往往使流速稍高于最佳流速。具体的：对

19、于填充柱，氮气的实用最佳线速为10-15cm/s；氢气为15-25cm/s；氦气介于两者之间。若填充柱内径为4mm，则体积流速为氮气30-40ml/min，氢气40-60ml/min。第56页/共87页柱温TcTc直接影响分析效能和分析速度。每一种固定液都有它的最高使用温度，柱温不可超过这一温度，否则固定液挥发流失。柱温太高，组分挥发度靠拢，不利于分离。但柱温太低，被测组分的扩散速度下降，分配不能快速达到平衡，影响峰型，柱效下降，并使分析时间大大延长。柱温选择的原则是，在保证难分离物质有良好分离的前提下（分离度满足要求），尽可能采取较高柱温，以缩短分析时间，保证峰型对称。第57页/共87页汽化

20、温度一般进样方法下，汽化温度比柱温高30-70。进样量大时高一些好，保证瞬间汽化。保证不可超过试样的分解温度。其它气化温度与具体进样方式有关。第58页/共87页检测器温度一般大于或等于柱温，具体与检测器种类有关。第59页/共87页进样量液体试样一般进样量0.1-5l。气体试样一般进样量为0.1-10ml。具体视柱类型，固定液含量（不能超过柱容量）、进样方式、检测器的灵敏度和线性范围等确定。第60页/共87页流动相（载气）种类流动相的种类要视检测器种类确定。常用的有氢气（热导用）、氮气（氢火焰用）、氦气（均可用，但价格较高）。氢气和氦气适合于快速分析。氮气做载气峰型较好，柱效较高。第61页/共8

21、7页三、色谱定性与定量方法三、色谱定性与定量方法第62页/共87页1.1.色谱定性分析(1)利用保留值及其规律定性 各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。利用纯物对照定性利用文献值对照定性第63页/共87页纯物质对照定性实现方法利用保留时间和保留体积定性 第64页/共87页用相对保留值定性 用已知物增加峰高法定性 第65页/共87页应用范围：适用于简单混合物，对该样品已有了解并具有纯物质的情况。优点：应用简便，不需要其他仪器。缺点：定性结果的可信度不高。提高可信度的方法：双柱、双体系定性第66页/共87页文献值对照定性分析（GC）实现方法测定相对保留值ri,s

22、测定保留指数I 优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。第67页/共87页(2)与其它仪器或化学方法联合定性与其它仪器或化学方法联合定性离线联用方式化学法仪器法在线联用方式化学法仪器法第68页/共87页离线联用方式收集方法：GC中一般采用液氮冷阱冷却后收集 应用范围：无标准物时，可对较为复杂的混合物进行定性分析缺点：麻烦第69页/共87页在线联用方式用化学方法辅助定性柱前反应：在色谱柱前装上预处理柱，带有某些官能团的化合物在预柱中发生物理化学变化，其色谱峰会消失或移动，与反应前色谱图比较

23、，可初步判断试样中含那些官能团。柱后反应：在色谱柱后装上型毛细管分流器，将各组分导入官能团试剂反应管，利用官能团反应对组分进行定性。第70页/共87页与其它仪器联用定性 混合物经色谱分离后，将各组分直接由接口导入其它仪器中进行定性。常用的联用方法有：GC-MS、GC-FTIR、LC-MS 其它仪器相当于色谱仪的检测器。使用范围：复杂样品的定性。优点：不需要标准物，定性结果可信度高，操作方便。缺点：需要特殊仪器或设备。第71页/共87页GC-MS第72页/共87页2 2 色谱定量分析色谱定量分析(1)色谱定量基础 色谱定量分析是基于被测物质的量与峰面积成正比。在一定色谱条件下有：第73页/共87

24、页（2）定量要解决的问题）定量要解决的问题峰面积的测量和计算校正因子的测量与计算色谱定量方法及其应用第74页/共87页峰面积的测量与计算积分仪或色谱工作站 简便、速度快，精度高，可达0.2-2%，对小峰及不对称峰的结果准确，是色谱发展趋势。手动测量与计算第75页/共87页峰高乘半峰宽法：适于对称峰峰高乘峰底宽度法：适于矮宽峰峰高乘平均峰宽法：适于不对称峰峰高乘保留值法：适于狭窄峰，快速简便，常用于工厂控制分析。第76页/共87页校正因子的测量与计算相对校正因子 由于绝对校正因子与仪器的灵敏度有关，又由于灵敏度与实验条件相关，且每一检测器的灵敏度都是不同的，它不容易测量准确，亦无通用性，所以实际

25、工作中使用相对校正因子。第77页/共87页n 相对校正因子的表达式质量校正因子 摩尔校正因子 相对响应值 被测组分的质量标准物质量分子量第78页/共87页n 相对校正因子的测量理论上相对校正因子与试样、标准物质、检测器类型、载气类型有关，与其它色谱条件无关。无纯物质时或对结果准确度要求不高时，相对校正因子可通过查表得。既无纯物，手册上又无数据时，可用一些计算方法估算这些物质的相对校正因子。第79页/共87页定量方法校正归一化法 含归一化内标法 含内标标准曲线法外标法 含单点校正第80页/共87页n 校正归一化法推导：第81页/共87页应用范围：当试样中各组分都能流出色谱柱，且在检测器上均有响应

26、，各组分峰没有重叠时，可用此法。优点：简便、准确，当操作条件如进样量等变化时，对定量结果影响很小，该法适合于常量物质的定量。缺点：对该法的苛刻要求限制了它的使用。第82页/共87页归一化法若各组分的定量校正因子相近或相同，则上式可简化为：第83页/共87页n 内标法推导 将一定量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样中。第84页/共87页适用范围：当只需测定试样中某几个组分，且试样中所有组分不能全部出峰时可用。优点：受操作条件的影响较小，定量结果较准确，使用上不象归一化法那样受到限制，此法适合于微量物质的分析。缺点：每次分析必须准确称量被测物和内标物，不适合于快速分析。第85页/共87页内标标准曲线法 fi,sms/m为常数K，此时Ci%=K(Ai/As)，以Ci%对1/As作标准曲线。优点：不必测校正因子，消除了某些操作条件的影响，方法简便，适合液体试样的常规分析。如白酒分析国标中采用此法。第86页/共87页感谢您的观看！第87页/共87页