菌种传代、使用、保存操作规程.doc

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1、菌种传代、使用、保存操作规程1. 目的本文件规定了微生物检验用菌、无菌检验用菌及抗生素检验用菌的接种、保存，传代方法及要求，适用于中心化验室进展检验用菌的接种和传代操作。2. 适用范围适用于中心化验室菌种治理人员进展检验用菌的接种、保存和传代操作。3. 职责菌种治理人员应按本程序的规定操作。4. 参考文件及相关程序B08(02)005微生物试验室标准治理程序B08(02)019微生物检验用菌标准治理程序B08(02)020检验用培育基标准治理程序5. 程序5.1. 比照菌株名称金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003 铜绿假单胞菌 CMCC(B) 10 104 生孢梭菌 CMCC(B) 6

2、4 941 枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63 501 大肠埃希菌 CMCC(B) 44 102 白色念珠菌 CMCC(F) 98 001 黑曲霉 CMCC(F) 98 003 短小芽孢杆菌 CMCC(B) 63 202 藤黄微球菌 CMCC(B) 28 001 乙型副伤寒沙门菌 CMCC(B) 50 094 5.2. 菌种来源中国药品生物制品检定所供给的冷冻枯燥菌种即安瓿。5.3. 微生物检验用菌菌悬液的制备5.3.1. 菌种的复苏与传代5.3.1.1. 取备妥的冷冻菌种安瓿，灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、灭菌水及复苏菌种所需的培育基等物品，移入超净工作台。菌种传代、使用、保存操作规程

3、5.3.1.2. 用 75% 酒精棉球擦净冷冻菌种安瓿外壁，放在灭菌双碟内，待干。5.3.1.3. 点燃酒精灯，将安瓿的封口一端在火焰上烧灼，用灭菌毛细管吸取灭菌水或胰酪大 豆胨液体培育基少许在灼热处，使其骤冷,用枯燥无菌纱布包裹安瓿，安瓿掰开。5.3.1.4. 在不离开火焰圈内，快速用注射器抽取约0.5ml 胰酪大豆胨琼液体培育基，注入安瓿内，轻轻震摇使冷冻菌块溶解、混匀，随即用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1 支胰酪大豆胨液体培育基， 1 支一般胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面培育基内。5.3.1.5将接种后的胰酪大豆胨液体培育基以及胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面置30 35恒温培育 18 24

4、 小时。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、乙型副伤寒沙门菌的颖培育物至胰酪大豆胨液体培育基中或琼脂培育基上， 接种生孢梭菌的颖培育物至硫乙醇酸盐流体培育基中 30 35恒温培育 18 24 小时； 接种白色念珠菌的颖培育物至沙氏葡萄糖培育基中或沙氏葡萄糖养分琼脂培育基上， 23 28恒温培育 24 48 小时；接种黑曲霉的颖培育物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上， 23 28恒温培育 5 7 天，参与 3 5ml 含 0.05% 聚山梨酯 80 的 0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱制成孢子悬液。5.3.1.6. 取出培育物，认真观看菌苔形态，如无杂菌，转接至2 支一般胰酪大豆胨琼脂斜面中，

5、于 30 35恒温培育 18 24 小时，同时作平板分别单个菌落及涂片镜检。5.3.1.7. 镜检呈典型的菌型后，取第 1 支用灭菌 0.9% 氯化钠溶液洗下菌苔，加液体石蜡液 体石蜡最终浓度为 10%，分装至冻存管中冻存管1ml/ 支于 -30条件下冷冻保存；第 2 支接种至胰酪大豆胨琼液体培育基中，置3035恒温培育 18 24 小时，分装至冻存管中冻存管1ml/ 支，参与液体石蜡，于 -30 条件下冷冻保存，作为工作用试验菌种也称为工作用菌种。5.3.1.8. 每次传代应作好记录，工作菌种的标签除标明菌种名称外，还应说明菌种编号，传代次数 ,传代日期，传代人，支数冻存管编号DC02-12

6、11-1-3-01，表示大肠埃希菌 2023年 11月购置的第一支菌种第 3代 1号冻存管； 复苏菌液编号DC02-1211-1-3-01-00 ，表示大肠埃希菌 2023 年 11 月购置的第一支菌种第 3 代 1号管复苏后的菌液，其中DC02 表示大肠杆菌。5.3.1.9. 每半年应对冻存管中每种菌的菌种生长状况进展一次复核试验，并记录。5.4. 斜面接种法5.4.1. 接种前用紫外光照耀 30 分钟以上，并用 75% 酒精棉球擦拭超净工作台进展灭菌。5.4.2. 预备好需用的培育基斜面，标签上注明菌种名称和接种日期。培育基的制备日期应在2周之内，如斜面已无凝水者不宜再用。5.4.3. 自

7、冰箱中取出菌种斜面，在室外温下放置约20 分钟，待温度与室温平衡后，再移入超净工作台。5.4.4. 点燃酒精灯，将菌种管斜面的棉花塞，通过火焰转动使稍稍松动，以便接种时易于拔取；第 8 页共 5 页为防止细菌污染，接种操作应在搪瓷方盘上方进展，以防止细菌微粒散落。5.4.5. 再将原来已有的菌种斜面培育基简称菌种管与待接种的颖斜面培育基简称接种 管，持在左手拇指、食指及中指之间，要留意能清楚观看到斜面，使菌种管在前，接 种管在后。应斜持使管呈45 度角，使试管内斜面对上，两试管口平齐，留意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培育基外表。5.4.6. 右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环置于火焰

8、上酒精灯外焰烧灼至烧红约 30 秒，以彻底灭菌，随后将全部铂金丝及金属棒局部在火焰上烧灼，接种柄一边转动， 一边渐渐地来回通过 4 次，烧灼时，应把接种环置于酒精灯的外焰上。5.4.7. 使用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔出两支试管的棉塞 并夹住棉塞，左手将试管口在火焰上旋转烧灼以杀死管口可能沾污的细菌，但勿烧烫。5.4.8. 用右手的拇指、食指和中指操作接种环，将灼烧过的接种环的铂金耳伸入菌种管内，先 接触无菌苔生长的培育基，如有熔印，则说明接种环未冷却，能烫死细菌。确定待冷却到室温后， 方可从斜面上挑取菌苔少许， 随即取出时接种环， 在火焰旁快速插入接种管， 在斜

9、面上轻轻划线接种，划线时一般先由下而上划始终线后，再由下而上划“s形”曲线。操作过程应快速，勿使菌种沾至管壁或管口，只能划动一次，切勿重复移动。如需同时接种几支菌种斜面时，刮一次菌苔后可以连续接各三支斜面。5.4.9. 从菌种管中取出接种环，马上将管口通过火焰灭菌，用右手在火焰旁将菌种管及接种管 的棉塞堵上，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的棉塞；然后将接种环在火焰上烧灼灭菌，应先将铂金耳离沾有细菌远端的铂金丝烧灼至红，使其传热至铂金耳使铂金耳上残留的菌苔渐枯焦、炭化后，才将铂金耳移至火焰中烧灼至红约 30 秒不要直接烧环， 以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间，再消毒接种环的金属局部，使其在

10、火焰上烧灼通过 3 次。5.4.10. 当接种完毕后，将接种后的一般胰酪大豆胨琼脂斜面培育箱中进展培育，细菌在 30 35 培育 18 24 小时，真菌在 23 28 培育 24 48 小时。取出，置室温约 1 小时， 待温度与室温平衡后放入冰箱 2 8内保存，并定期进展传代和接种菌种斜面每 1 个月用一般胰酪大豆胨琼脂斜面传代一次，芽孢杆菌每 3 个月用一般胰酪大豆胨琼脂斜面传代一次，菌种传代不超过 5 代。5.5. 工作用菌种冻存管的使用5.5.1. 接种前用紫外光照耀 30 分钟以上， 并用 75% 酒精棉球擦拭超净工作台进展灭菌。 预备好适宜的培育基，标签上注明菌种名称和接种日期。5.

11、5.2. 自冰箱中取出菌种冻存管，在培育箱复苏约60 分钟，待解冻后，移入超净工作台。5.5.3. 点燃酒精灯，用无菌注射器吸出菌液，接种至培育基中，30 35培育 18 24 小时。5.5.4. 将上述培育物吸出 1ml，用 0.9% 无菌氯化钠溶液逐级稀释，制成每 1ml 含菌数为 50 100cfu 的菌悬液，备用。菌悬液在室温下放置应在 2 小时内使用，假设保存在 2 8可在 24 小时内使用。5.6. 无菌检查用菌菌悬液的制备 按 5.3 中的工作用菌种冻存管接种方法操作，接种好所需的比照菌株冻存管分别接种至养分琼脂培育基斜面及胰酪大豆胨液体培育基中，将接种后的胰酪大豆胨琼脂斜面及胰

12、酪大豆胨液体置 30 35 恒温培育 18 24 小时。取出培育物，认真观看斜面菌苔形态，确认无杂菌。接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌至胰酪大豆胨液体培育基中或琼脂培育基上，接种生孢梭菌至硫乙醇酸盐流体培育基中30 35 恒温培育 18 24 小时；接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖培育基中或沙氏葡萄糖养分琼脂培育基上， 23 28 恒温培育 24 48 小时 金黄色葡萄球菌菌液： 取金黄色葡萄球菌的胰酪大豆胨液体颖培育物1ml ，用 0.9% 无菌氯化钠溶液稀释至每 1ml 中含菌 10 100 个。 铜绿假单胞菌菌液： 取铜绿假单胞菌的胰酪大豆胨液体颖培

13、育物1ml ，用 0.9% 无菌氯化钠溶液稀释至每 1ml 中含菌 10 100 个。 生孢梭菌菌液： 取生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培育基颖培育物1ml ，用 0.9% 无菌氯化钠溶液稀释至每 1ml 中含菌 10 100 个。 枯草芽孢杆菌菌液： 取枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体颖培育物1ml ，用 0.9% 无菌氯化钠溶液稀释至每 1ml 中含菌 10 100 个。 大肠埃希菌菌液： 取大肠埃希菌的胰酪大豆胨液体颖培育物1ml ，用 0.9% 无菌氯化钠溶液稀释至每 1ml 中含菌 10 100 个。 白色念珠菌菌液： 取白色念珠菌的沙氏葡萄糖培育基颖培育物1ml ，用 0.9% 无菌氯化钠溶

14、液稀释至每 1ml 中含 10 100 个菌。 黑曲霉：取黑曲霉菌的冻存管 1 支，接种至沙氏葡萄糖琼脂培育基斜面， 在 23 28 培育 5 7 天，参与 3 5ml 含 0.05% ml/ml 聚山梨酯 80 的 0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。移至无菌试管内，用含0.05% ml/ml 聚山梨酯 80 的 0.9% 无菌氯化钠溶液稀释至每1ml 中含 10 100 个菌。5.7. 抗生素微生物菌悬液的制备 按 5.3 中的工作用菌种冻存管接种方法操作，接种好所需的比照菌株冻存管。 枯草芽孢杆菌悬液：取枯草芽孢杆菌冻存管 1 支接种至养分琼脂培育基瓶中，在 35 37 培育 7 日，

15、用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢 85% 以上。用灭菌水将芽孢洗下， 65 加热30 分钟，备用。 短小芽孢杆菌悬液：取短小芽孢杆菌冻存管 1 支接种至养分琼脂培育基瓶中，在 35 37 培育 7 日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢 85% 以上。用灭菌水将芽孢洗下， 65 加热30 分钟，备用。 藤黄微球菌悬液：取藤黄微球菌悬液冻存管 1 支接种至养分琼脂培育基瓶中，在 26 27 培育 24 小时，用 0.9% 灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。5.8. 菌种的保存 工作用菌种冻存管置于-30 条件下冷冻保存。 菌种斜面置于 28保存。 菌悬液置于 2 8保存。6. 环境保护、安康、安全

16、接种完毕后，应马上用消毒酒精擦拭台面，并用紫外灯照耀30 分钟以上，防止污染。 菌液及带菌器具应准时放入湿热蒸汽灭菌器中121灭菌 30min 后再清洗。 在接种进程中，假设棉塞因不慎着火，切勿用口吹，必需在刚刚着火时，快速将棉塞塞入试管，使棉塞在试管内因氧气缺乏而很快熄灭。 灼烧带菌接种环时，不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间及操作人员。 如在操作过程中，不留神使细菌溅落，应马上用消毒酒精擦拭被染部位，以防止污染。 假定试验工作衣受污染，应马上脱下翻转包裹，使污染局部包在内部，送往消毒，经灭菌处理后，再洗涤灭菌处理后用。 因偶然打破盛有培育物的器皿，致使病原性的菌毒种外溢，

17、污染了工作室及操作者的衣物及体表时， 当事人应冷静，切勿乱动以免扩大污染面。应唤他人用浸透消毒液的毛巾或纱布掩盖于碎片上，或将 消毒液 2%的甲酚皂或 0.2%的洁尔灭溶液倒在污染区，浸没一段时间。先从外至内逐步清理污染源，最终将衣物彻底灭菌。清理时应避开用手指收集玻璃碎片，以防损伤皮肤，造成病原性微生物感 染事故。 对一般小面积的污染可自行处理，较大范围的污染则请人帮助。7. 附录无8. 记录2023 0105002 01菌种选购与验收表2023 0105002 02菌种收发记录2023 0105002 03菌种传代记录2023 0105002 04菌种使用记录2023 0105002 05废弃菌灭活处理记录2023 0105002 06菌种标签2023 0105002 07菌种生长状况复核记录