第八章基因工程.pptx

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1、基因克隆示意图第1页/共84页第2页/共84页基因工程大事记1973 Cohen第一例成功的克隆实验1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 第3页/共84页1993 基因工程西红柿在美国上市1997 英国罗斯林研究所 多莉羊1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%科学家公布人类基因组工作草图 公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程第4页/共84页胰岛素人生长激素干扰素白细胞介

2、素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体第5页/共84页自然界的基因转移和重组基因重组(genetic recombination)整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的第6页/共84页结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用 transformation 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程第7页/共84页转导作用 tra

3、nsduction病毒、噬菌体介导溶菌途径；溶原菌途径第8页/共84页基因工程工具酶载体重组DNA技术的基本过程真核细胞转染克隆基因的表达第9页/共84页工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶切割切割DNADNA连接酶连接酶生成生成3-5磷酸二酯键磷酸二酯键DNA聚合酶聚合酶探针标记、补平探针标记、补平3末端末端反转录酶反转录酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记磷酸化、探针标记末端转移酶末端转移酶3末端多聚尾末端多聚尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基常用的工具酶：第10页/共84页一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)(Arber)、史

4、密斯(Smith)(Smith)和内森斯(Nathans)(Nathans)，获19781978年诺贝尔生理学和医学奖第11页/共84页1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。假设：限制性内切酶与修饰酶。第12页/共84页第13页/共84页第14页/共84页1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1

5、000碱基的片段。识别和切割序列：中心对称的回文结构。限制性酶：HindNathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。第15页/共84页限制性核酸内切酶(restriction enzyme)识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：型、型、型命名：EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序)第16页/共84页识别和切割位点回文结构 46 bp出现两种末端粘性末端 粘端 平头末端 平端 同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端第17页/共84页粘性末端与平头末端第18页/共84页修饰酶DNA聚合酶逆转录酶(revers

6、e transcriptase)T4DNA连接酶(T4 ligase)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)末端脱氧核苷酰转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)Taq DNA聚合酶第19页/共84页DNA聚合酶(pol)的活性5至3的聚合活性5 3方向核酸 外切酶活性5 3外切酶活性3 5外切酶活性pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段 （Klenow片段）：聚合活性、3 5外切活性 常用的工具酶第20页/共84页核酸外切酶活性35外切酶活性53外切酶活性第21页/共84页第22页/共84页第23页/共84页第

7、24页/共84页末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)第25页/共84页载体 vectorDNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC）噬菌体（，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等第26页/共84页第27页/共84页常用的克隆载体质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒 拷贝数多;两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因(lac Z)筛选标志多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)第28页/共84页

8、第29页/共84页第30页/共84页第31页/共84页第32页/共84页常用的克隆载体噬菌体(phage)基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区DNA，替换型载体，外源DNA：923kb常用：EMBL 系列、gt 系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：DNA的 cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：4050kbM13噬菌体最大优点：产生单链DNA第33页/共84页第34页/共84页第35页/共84页第36页/共84页第37页/共84页第38页/共84页第39页/共84页cos:cohesive-end site特点：第40页/共84页第41页/共84页第42页/共8

9、4页RF DNA:replicational form DNA优点：第43页/共84页表达载体(expressing vector)特点：带表达构件转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列第44页/共84页第45页/共84页第46页/共84页第47页/共84页哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子克隆位点终止信号和加poly(A)信号第48页/共84页重组DN

10、A技术的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定第49页/共84页目的基因(target DNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA-基因文库(genomic library)存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNA -cDNA文库(cDNA library)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成第50页/共84页第51页/共84页第52页/共84页第53页/共84页第54页/共84页第55页/共84页载体的选择和制备：噬菌体、粘性质粒、pUC系列、M13噬菌体DNA分子的体外连接（DNA连接

11、酶）粘性末端连接 连接效率高相同酶切末端平端连接 连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法第56页/共84页第57页/共84页第58页/共84页第59页/共84页第60页/共84页同聚物接尾法第61页/共84页将外源DNA导入宿主细胞基因工程菌 HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。第62页/共84页

12、目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 标志补救 表达产物与营养缺陷互补 -互补 蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交 探针原位杂交 PCR限制性酶切图谱 第63页/共84页第64页/共84页第65页/共84页第66页/共84页IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)第67页/共84页第68页/共84页 bp1534 994 695 515 377 237 A B C M 第69页/共84页第70页/共84页第71页/共84页克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件；密码子通用

13、原核表达体系 原核表达载体的标准合适的筛选标志强启动子翻译控制序列多克隆位点第72页/共84页融合蛋白（fusion protein,包涵体）表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编目。大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难表达大量的可溶性蛋白第73页/共84页第74页/共84页真核表达体系转染方法磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染；人造膜显微注射筛选标志 tk-Neor G418瞬时转染 目的基因不整合进宿主基因组稳定转染 目的基因整合进宿主基因组第75页/共84页tk-细胞突变株筛选转染细胞胸苷激酶（tk）TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷）tk+：生长tk-+带tk基因的质粒：生长第76页/共84页药物筛选转染细胞neor新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成G418：干扰原核、真核生物neo：磷酸转移酶，使G418失活neo 与目的基因连锁,转染第77页/共84页目的基因的定点诱变及其应用基因定点诱变技术基因定点诱变技术的应用第78页/共84页第79页/共84页第80页/共84页第81页/共84页第82页/共84页第83页/共84页感谢您的观看！第84页/共84页