hiv核酸检测技术2014-课件.ppt

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1、HIV核酸检测及婴幼儿诊断HIV核酸检测的意义早期诊断婴儿的早期诊断：HIV感染母亲所生小于18个月龄的婴儿，不同时间的两次HIV核酸检测均为阳性即可作出诊断。18个月龄以上儿童诊断与成人相同：有急性HIV感染综合症或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性，即可诊断。也可使用多样品集合的方法，对采供血机构的原料血浆以及HIV抗体阴性的高危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染，降低“残余危险度”，减少二代传播。疑难样本的辅助诊断在一般情况下，HIV抗体检测足以对HIV感染与否做出正确诊断，但在特殊情况下，单纯HIV抗体检测结果不能进行明确的诊断，如在感染早期或疾病终末期出

2、现抗体不确定反应时，RNA的测定结果可帮助提供HIV感染早期或终末期的证据。由于试剂的灵敏度、接受有效的抗病毒治疗后以及存在长期低水平病毒的少数感染者等原因，应对其它检测数据和样品背景情况进行综合判断。遗传变异监测可用于HIV分子流行病学监测，包括HIV-1和HIV-2感染的鉴别诊断、HIV感染传播链的分析、HIV基因亚型和重组病毒的鉴定和分析以及人群HIV遗传变异趋势的监测病程监控及预测HIV感染发生后病毒载量变化具有一定规律，这种变化与疾病的进程有着密切的相关性。因此定期进行病毒载量检测有助于确定疾病发展的阶段，以确定相应的治疗方案指导抗病毒治疗及疗效判定通常在病毒载量达到一定水平后（如3

3、5，00050，000c/ml）抗病毒治疗才显示良好的治疗效果。治疗后，通过病毒水平的检测能够确定治疗是否有效。通常在治疗6个月后病毒水平降低0.5log以上才被认为临床有效。样本采集原则样品恰当的采集、保存和运送是所有检测需要考虑的很重要的一部分。样品的采集和保存时，要使用无菌技术，包括消毒管、吸头和试剂及工作环境都要防止样品污染。血浆中RNA量比血清中高并稳定。全血中病毒载量非常不稳定。EDTA抗凝的RNA比肝素、ACD好，并且肝素对PCR扩增有抑制作用。（用ACD抗凝的样品检测结果大约会比EDTA抗凝的样本低15)采集的样品应在48小时以内分离血浆。样品的保存用于核酸检测的血浆和血细胞样

4、品应冻存于20以下，进行病毒RNA检测的样品如长期（3个月以上）保存应置于80或液氮里。实验室设置原则明确实验室的设置原则和工作流程设计，最终目的是为避免实验室污染。明确实验室设置和工作流程中好的和不好的实例。明确我们当前实验室设置中，为避免实验室污染有必要进行的整改。要点：各区必须是相互独立的，有条件各区内分别设置缓冲间，以保证不同区之间始终完全分开。各区的仪器设备以及各种物品必须专用。试剂准备区和样品处理区科保持低度正压或常压，是空气始终由室内流向室外，以避免扩增物进入此区。扩增产物分析区保持低度负压，可安装排风扇或其他排风装置。也可以设在远离其他各区的地方。工作时必须遵循单一工作流向进行

5、，工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。13PCR 工作站(Dead-air Cabinets)15三实验室布局(备选 2A)实验室 2“样品处理和PCR Lab样品接收储存提取和第一轮PCR反应混合样品Frozen plasmaWhole bloodDBS1st round amplification2nd round PCR set-up实验室 1“无

6、模板 Lab试剂储存主反应混合物制备实验室 3“扩增后 Lab第二轮扩增、电泳分析、测序反应和毛细管电泳在密闭箱中以专用加样器操作16三实验室布局(备选 2B)实验室 3“扩增后 Lab1st round amplification2nd round PCR set-up第二轮扩增、电泳分析、测序反应和毛细管电泳如果不需进行nestedPCR，备选 2B 更理想样品Frozen plasmaWhole bloodDBS实验室 1“无模板 Lab试剂储存主反应混合物制备实验室 2“样品处理和PCR Lab样品接收储存提取和第一轮PCR反应混合在密闭箱中以专用加样器操作试剂配制只能在规定区域完成，

7、配制完后，试剂必须及时放回存放区。加样和扩增只能在规定区域完成，加完后盖紧盖子并作好标记。操作超过10分钟时应将反应管置于冰盒内。扩增仪预热不少于20分钟扩增产物分析酶切、电泳、杂交等，在产物分析区完成定量检测通常采用商用系统。结果判定和报告定性检测：HIV核酸检测阴性，只能报告本次实验结果阴性，不排除感染可能。HIV核酸检测阳性，可作为感染的辅助诊断指标，不单独用于感染的诊断。报告结果是应注明反应条件和引物序列。2023/4/1028常用的病毒载量测定方法 分枝DNA信号放大系统 HIV-1Quantiplex(bDNA)逆转录PCR系统 AmplicorHIV-1Monitor（RT-PC

8、R）核酸序列扩增系统 NucliSensHIV-1QT（NASBA）2023/4/1029RocheBayer(前Chiron)Organon技术RT-PCRbDNANuclisensHIV-1QT结果比较约2xbDNA2.02.0版结果约为RT-PCR的50%，3.0版结果与Roche基本相同与Roche基本相同优点通过了FDA认证假阳性结果较bDNA少1.5版对A-G亚型有较好的反应性操作时间较少对A-G亚型有较好的反应性通过了FDA认证可使用多种组织，如生殖道分泌液对A-G亚型有较好的反应性检测范围大缺点操作容易污染测定范围较小（相对于NASBA）少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾

9、液早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B亚型的样品反应性普遍较差，（5）版通过改进对O亚型检测能力较差对低值样品检测的特异性较差。无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR50%，3.0版结果与Roche基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。操作复杂，样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的手工操作。不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测

10、。实验内、外误差相对较大。检测范围标准版(Amplicor1.0及1.5)400-750,000c/mL超敏版(Ultra-Direct1.0and1.5):50-75,000c/mLbDNA3.0版:100-500,000c/mLNuclisensHIV-1QT:40-10,000,000c/mL(取决于样品量)各种HIV定量检测方法的比较2023/4/1031提高敏感性的方法 增加标本用量，例如从500l血浆增加到1ml 离心沉淀病毒颗粒，离心时间从60min延长到80minat23,600 xg 减少内部定量标准的体积，例如从25l减少到6.6lperlysisvial 减少沉淀的病毒重

11、悬的体积，例如从100l减少到55l 加底物孵育时间延长1015min2023/4/1032假阳性(False Positive)控制污染物理隔离PCR前后的反应器械专用（加样器、吸头、离心机、离心管、手套、工作服、笔）分装试剂阳性和阴性对照最近的进展防气溶胶吸头半自动操作封闭试管系统（实时PCR）全自动（样品处理扩增检测）2023/4/1033假阴性(False Negative)原因序列变异丢失核酸样本核酸样品被消化抑制DNA聚合酶的活性预防避免肝素、血红蛋白、乙醇、酚、SDS使用合适的提取技术检测阳性对照内部对照选择病毒载量检测的注意事项方法的线性范围、特异性、重复性、对不同亚型的检测性

12、能检测试剂和耗材等消耗品对人员和实验室的要求、可操作性样本的运输、保存、样品量质量控制：污染控制、室内控制和室间控制自动化操作程度检测时间病毒载量测定的基本要求仪器需要按公司要求的进行定期维护加样器的校准水浴箱的温度校准实验室的处理检测实验室的分区婴幼儿HIV感染核酸检测HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸（DNA或RNA）检测进行早期HIV感染诊断。尽管HIVRNA检测敏感性在感染早期较高（出生后1个月内），但是HIVDNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰而影响早期诊断。另外，考虑母亲血液污染因素，不推荐

13、使用脐带血进行HIV核酸检测。适用范围未满18个月的HIV感染产妇所生婴幼儿；未满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染者检测程序及结果报告滤纸片载体及其特性（1）作为血液载体，滤纸应具备极强的吸水性、厚度均一、液体流速一致、纯度高、没有污染、FDA在册，据不同的检测需求选择不同类型的滤纸。滤纸干血斑样本特点（1）需要样本量少，仅50-100l；易采集，末梢血即可，适用婴儿和静脉采血困难者；样本安全，生物危险性低，费用低廉的运输方式，可直接邮寄，被IATA归入最低危险水平；室温保存减少了保存费用，密封袋中加干燥剂和湿度指示剂.滤纸片载体及其特

14、性（2）滤纸选择指南滤纸选择指南样本采集样本采集滤纸类型滤纸类型检测对象检测对象是否长是否长时间常时间常温保存温保存是否关心杀是否关心杀菌剂、杀毒菌剂、杀毒剂、抗真菌剂、抗真菌成分成分是否样本含是否样本含有色素如：有色素如：血液、粪便、血液、粪便、血清、植物血清、植物或哺乳细胞或哺乳细胞样本是否样本是否为清洁的为清洁的生物性液生物性液体入：口体入：口腔粘膜细腔粘膜细胞、精液、胞、精液、尿液尿液DNADNAproteiprotein nRNARNAS&S 903S&S 903否否*否否是是否否Isocode(FIsocode(FTATA标准卡标准卡)是是是是是是否否IsocodeIDIsocod

15、eID（FTAFTA指示指示型卡）型卡）是是是是否否是是*903903滤纸上的样本可在滤纸上的样本可在-20-20长期保存，蛋白的保存时间依据特异蛋白特性，见后。长期保存，蛋白的保存时间依据特异蛋白特性，见后。滤纸片干血斑作为一种有效载体在HIV检测中具有非常重要的作用定性检测HIV抗体定量检测HIV的病毒载量HIV耐药性检测HIV新发感染的检测快速检测的一种质控手段定性检测前病毒DNA,婴幼儿早期诊断HIV耐药检测抗病毒治疗的效果：大幅度降低病毒载量 提升CD4细胞数 改善症状，延长生存期。抗病毒治疗存在问题：毒副作用大 患者依从性差 耐药性毒株的出现什么是什么是HIV耐药性？耐药性？HIV

16、耐药性是指病毒通过自身的遗传变异，产生对药物抑制作用敏感性降低或不敏感的现象。AvailableAntiretroviralAgentsNucleoside Analogs 1.AZT,zidovudine,Retrovir2.ddI,didanosine,VidexEC3.ddC,zalcitabine,Hivid4.d4T,stavudine,Zerit5.3TC,lamivudine,Epivir6.abacavir,Ziagen7.FTC,emtricitabine,EmtrivaNucleotide Analogs 8.tenofovir,VireadNon Nucleoside R

17、T inhibitors9.delavirdine,Rescriptor 10.nevirapine,Viramune11.efavirenz,Sustiva12.etravirine,IntelenceProtease Inhibitors 13.indinavir,Crixivan+/-r14.saquinavir Invirase+r15.ritonavir,Norvir16.nelfinavir,Viracept17.lopinavir+r,Kaletra18.atazanavir,Reyataz+/-r19.fos-amprenavir,Lexiva+/-r20.tipranavir

18、,Aptivus+r21.darunavir,Prezista+rFusion Entry Inhibitors22.enfuvirtide,Fuzeon CCR5 Entry inhibitors23.maraviroc,SelzentryIntegrase inhibitors24.raltegravir,Isentress药物的作用机制药物的作用机制核苷类逆转录酶抑制剂：被靶细胞的细胞酶磷酸化后，以三磷酸的形式与天然三磷酸竞争，从而参与病毒DNA的合成，由于该抑制剂经化学修饰，将导致病毒DNA链合成终止。药物的作用机制药物的作用机制非核苷类逆转录酶抑制剂：是一组结构多样化的化合物，通过非

19、竞争性的方式结合于或者接近于病毒逆转录酶的活性位点，从而抑制病毒逆转录酶的活性。药物的作用机制药物的作用机制蛋白酶抑制剂：肽类似物，通过结合于病毒蛋白酶的活性位点来抑制酶的活性，使之不能将病毒合成的多聚前体蛋白水解为病毒的各种结构蛋白和酶的组成部分。耐药性是怎么产生的？耐药性是怎么产生的？一、病毒本身的因素一、病毒本身的因素内因内因1.1HIV的逆转录酶（RT）不具有DNA聚合酶的校正功能，因此，在复制过程中，病毒核酸表现出高度的错误倾向性。1.2在病毒的高速复制过程中，高频率突变在很短的时间内随时发生耐药性是怎么产生的？耐药性是怎么产生的？二、药物的选择压力外因1.1在药物选择的压力下，耐药

20、变异株完全取代药物敏感株最快能发生在14至28天内。1.2耐药株是在病毒自发的、高频率的基因突变中产生的，在药物选择性的压力下优势复制的结果。哪些因素促使耐药性病毒株出现？哪些因素促使耐药性病毒株出现？1.病毒载量2.服药的依从性3.药物的配伍不当4.其他因素：胃肠道吸收不好，随意间歇服药，与中药或其他药物同时服用。HIV-1耐药检测的意义耐药检测的意义耐药监测用于HIV-1感染人群和抗病毒治疗人群的耐药性监测和检测。用于新近感染人群的耐药性监测，了解耐药毒株流行的情况，并采取防控措施，用于治疗前人群的监测，指导制定一线抗病毒治疗方案；用于抗病毒治疗人群的耐药性监测，进行HIV-1耐药发生、发

21、展趋势以及影响因素的分析，指导和完善大规模公共卫生模式抗病毒治疗的程序，以及制定二线治疗方案。耐药检测用于个体患者的耐药检测。在抗病毒治疗前进行耐药检测，可指导临床医生制定抗病毒治疗方案，保证抗病毒治疗的效果；在抗病毒治疗过程中进行耐药检测，可指导临床医生分析治疗失败的原因，并制定补救治疗方案如何检测耐药株？如何检测耐药株？目前耐药性检测有2种方法：表型检测表型检测和基因型检基因型检测测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用低，技术也相对容易，可在样品收集后12周得到结果，但分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知

22、识，如突变与抗病毒药物及其他药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测可以通过直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛运用于临床的是基因型耐药检测。表型检测方法表型检测方法表型耐药性检测表型耐药性检测克隆病毒克隆病毒RT、PR基因基因分离病毒分离病毒在药物存在的情况下培养在药物存在的情况下培养计算计算IC50插入含报告基因的骨架病毒插入含报告基因的骨架病毒转染细胞转染细胞在药物存在的情况下培养在药物存在的情况下培养计算计算IC50改良改良方法方法传统传统方法方法表型耐药性检测优点：直接定量测定耐药性结果容易解释有临床临界值（cut-off)可

23、立即检测对新药的耐药性缺点：操作复杂、价格昂贵、耗时长HIV基因型耐药性检测基因型耐药性检测（序列测定法）基因型检测方法基因型检测方法（序列测定法）（序列测定法）病人血浆标本病人血浆标本HIV RNA病毒病毒 cDNAHIV RT 和和PR基因片断基因片断序列测定序列测定结果解释结果解释RNA提取提取逆转录逆转录PCR扩增扩增特定的解释系统特定的解释系统标本新鲜EDTA抗凝血浆，或-80保存，避免反复冻融。病毒病毒RNA提取提取（Qiagen公司试剂盒）公司试剂盒）裂解标本，灭活裂解标本，灭活RNA酶酶加到离心柱中，加到离心柱中，RNA与硅胶膜结合与硅胶膜结合洗两次，去除杂质洗两次，去除杂质用

24、无用无RNA酶的缓冲液洗脱酶的缓冲液洗脱RNA收集收集RNA备用备用优点：操作简便优点：操作简便、快速快速、得率高得率高核酸扩增类试剂的操作主要步骤核酸（DNA和RNA）的扩增扩增产物的检测HIV-1耐药基因型解释系统 提供HIV-1耐药基因型检测数据分析和解释系统（HIVDRDB）的主要机构有：国际艾滋病协会The International AIDS Society-USA(IAS-USA)美国斯坦福大学The HIV Drug Resistance Database(Stanford University)法国国家艾滋病研究署The French ANRS(National Agency

25、 for AIDS Research)比利时Leuven大学Rega医学研究所Rega Institute for Medical Research in Katholieke Universiteit Leuven(REGA)耐药性突变记分耐药性突变记分高度耐药：大于60分中度耐药：3059分低度耐药：1529分潜在低度耐药：1014分敏感：09分HIV-1耐药性检测的临床指征耐药性检测的临床指征1.抗病毒治疗病毒类失败需要改变抗病毒治疗方案时应进行耐药性检测以协助选择有效的抗病毒药物。2.抗病毒治疗病毒载量下降不理想时可进行HIV-1的耐药性检测。3.抗病毒治疗失败需要进行耐药性检测时，应

26、该在病人仍在服药时或停药后立即（4周内）进行检测。HIV-1耐药性检测的临床指征耐药性检测的临床指征4.急性HIV-1感染的病人进行抗病毒治疗，最好进行耐药性检测，对于选择合适的抗病毒药物、取的最佳抗病毒效果很有益处。5.对于未经抗病毒质量的慢性HIV感染者不一定要做耐药性检测，但当有迹象显示感染的是耐药性HIV毒株时（例如感染来自于正在服用抗病毒药物的病人），就应当进行耐药性检测。6.不推荐对病毒载量1000拷贝/ml者进行耐药检测，对病毒载量500但1000拷贝/ml者尽管耐药检测不易成功但也应考虑进行检测。初次或二次治疗失败，推荐进行基因型耐药检测。多次治疗失败或明确或怀疑患者存在复杂耐

27、药突变位点尤其是对蛋白酶抑制剂类药物耐药，推荐基因型耐药和表型耐药分析联合应用。初始治疗方案病毒抑制不理想推荐进行耐药检测。HIV感染孕妇推荐对所有孕妇抗病毒治疗前进行基因型耐药检测。对已接受抗病毒治疗孕妇只要能检测出HIV RNA也应进行耐药检测。母婴传播感染的新生儿推荐对所有母婴传播感染的新生儿抗病毒治疗前及改变治疗方案前进行耐药检测。暴露后预防用药如果可能，暴露后预防用药需考虑暴露源的治疗史和耐药情况。推荐对暴露源进行基因型耐药检测。抗病毒治疗中断4周以上一般不推荐进行耐药检测。血浆HIV病毒载量500拷贝/ml一般不推荐进行耐药检测。儿童HIV感染的诊断儿童感染HIV的途径大部分儿童感

28、染大部分儿童感染HIVHIV是由母婴传播是由母婴传播。宫内经胎盘传染、产时分娩过程中创伤性宫内经胎盘传染、产时分娩过程中创伤性操作和经产道分泌物传染、生后母乳喂养操作和经产道分泌物传染、生后母乳喂养经乳汁传染。经乳汁传染。血液传播血液传播 儿童艾滋病的流行病学特点全世界已有百万儿童感染了全世界已有百万儿童感染了HIVHIV。7590%7590%的小儿感染的的小儿感染的HIVHIV来自母亲。来自母亲。育龄女性育龄女性HIVHIV感染者急剧增加。感染者急剧增加。造成儿童感染艾滋病人数大幅度增长。造成儿童感染艾滋病人数大幅度增长。儿童HIV/AIDS诊断（一）流行病学史1.母亲HIV阳性。2.有输血

29、或血液制品史，或有与他人共用注射器或医疗器械或接受未筛查的器官或组织移植史。.儿童HIV/AIDS诊断(二)临床表现:宫内感染的胎儿往往发生早产、死产和低体重儿（低于2500g）起病急，进展快机会性感染发生比例高，特别是反复的普通细菌感染发育迟缓或停止感染婴儿平感染婴儿平均均S/CO值随值随月龄变化曲月龄变化曲线（线（24个感个感染婴儿染婴儿(3个个死亡死亡)，82个个样本）样本）n:样本数样本数 婴幼儿感染诊断：婴幼儿感染诊断：12月内核酸检测，月内核酸检测，13-17月先抗体，阳性月先抗体，阳性者检测核酸，者检测核酸，18个月以上抗体检测个月以上抗体检测儿童HIV感染的诊断方法病毒培养：3

30、个月内婴儿敏感度90%,6个月婴儿接近100%.价格昂贵，时间长.HIV核酸:采用PCR检测外周血单核细胞或组织中HIV前病毒DNA，或用RT-PCR检测血清中RNA.敏感度和特异性与病毒培养相似.以上方法适用于母亲HIV阳性的出生1个月后的婴儿.任何一种非脐血标本阳性,即可怀疑诊断.儿童HIV感染的诊断方法病毒抗原检测：游离P24抗原检测,特异性极高,敏感度低;免疫复合物分离的P24（ICDP24）抗原检测,敏感性大大增加.血清抗体检测:ELISA和WB方法.核酸检测核酸检测流程流程儿童HIV感染的排除诊断母亲HIV阳性，婴儿出生6个月后多次查HIV抗体阴性，无P24抗原或HIV病毒阳性结果，无任何HIV感染临床表现可排除HIV感染。大于18月儿童,ELISA和WB阴性即可排除HIV感染.为保证检测结果的科学准确，通常依据不同时间所采的两份标本和联合检测手段儿童HIV感染发生阶段的判断母婴传播儿童感染HIV:48小时内HIV-RNA分离或培养阳性-宫内感染。1周-3月内HIV-RNA分离或培养阳性-分娩期感染，不排除妊娠晚期感染。出生后3月内病毒标记阴性，3月后阳性-产后（母乳）感染。