酸性磷酸酶的.pptx

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1、概 述酶在物质代谢及调节中的重要意义；常用的酶蛋白分离纯化方法；酶类检测在临床生化检验中的意义；酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。第1页/共25页目 的 要 求1.巩固诊断酶学有关的理论与实验知识；2.掌握酶的分离纯化方法；3.掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因素；4.熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。第2页/共25页试剂与器材一、一、ACP的分离纯化试剂：见实验的分离纯化试剂：见实验教材教材P31；二、二、ACP动力学分析试剂：见实验动力学分析试剂：见实验教材教材P35；三、三、器材：普通离心机，器材：普通离心机，721分光光分光光度计，恒

2、温水浴箱，研钵等。度计，恒温水浴箱，研钵等。第3页/共25页实 验 内 容一、一、ACP的分离纯化的分离纯化二、二、ACP的比活性分析的比活性分析三、三、ACP的动力学分析的动力学分析 1.时间进程（时间进程（t-V）曲线）曲线 2.酶浓度酶浓度-速度（速度（E-V）曲线）曲线 3.pH-酶活性酶活性（pH-V）曲线）曲线 4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V）曲）曲线线 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-V）曲线）曲线第4页/共25页一、一、ACP的分离纯化的分离纯化 1.概况：概况：ACP分布广泛分布广泛 分子量分子量100kD 最适最适pH5.0 热稳定性较好热稳定性较好 溶解度较高

3、溶解度较高 临床应用广临床应用广第5页/共25页2.ACP的分离纯化方法的分离纯化方法 根据根据ACP的理化性质，可以用层析、电的理化性质，可以用层析、电泳、透析等多种方法分离纯化。泳、透析等多种方法分离纯化。本实验采用分级离心本实验采用分级离心+分段盐析法：分段盐析法：ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以次逐步离心分离；不同，以次逐步离心分离；ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在在70C仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。沉淀和分段盐析。第6页/共25页3.ACP分离

4、纯化的步骤流分离纯化的步骤流程程 小麦胚芽小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水冷蒸馏水 滤滤 液液研碎，研碎，4层纱布过滤层纱布过滤3500rpm，10min离离心心 上清液上清液 I4000rpm，10min离心离心1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液上清液 I 上清液上清液 II（激活并稳定ACP，沉淀杂蛋白）缓慢搅拌第7页/共25页4000rpm，8min离心离心 上清液上清液5000rpm，10min离心离心饱和硫酸铵饱和硫酸铵 54ml/100ml上清液上清液 II 上清液上清液 II（溶解ACP，沉淀杂蛋白）4000rpm，8min离心离心 上清液上清液 III70C

5、水浴水浴2min冷水浴冷水浴3min饱和硫酸铵饱和硫酸铵 51ml/100ml上清液上清液 II 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（沉淀ACP）缓慢搅拌缓慢搅拌第8页/共25页4000rpm，10min离心离心约约1/3上清液上清液 III蒸馏水，蒸馏水，溶解，洗涤溶解，洗涤（溶解ACP，沉淀杂蛋白）4000rpm，10min离心离心 上清液上清液 IV 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物）（沉淀ACP）EDTA9ml，饱和硫酸铵，饱和硫酸铵10ml/100ml上清液上清液 IV，2倍体积预冷甲醇倍体积预冷甲醇 沉沉 淀淀（酶纯化物）（酶纯化物）4000rpm，10min离心离心蒸馏水溶解，洗涤蒸

6、馏水溶解，洗涤 上清液上清液 V（酶液）（酶液）缓慢搅拌第9页/共25页 1.各各上清液中蛋白质含量测定上清液中蛋白质含量测定 原理：染料结合比色法原理：染料结合比色法CBBG-250，max=595nm；步骤：标准曲线制作步骤：标准曲线制作 各上清液中总蛋白测定（做平行管，进各上清液中总蛋白测定（做平行管，进 行重复实验，减少随机误差。行重复实验，减少随机误差。二、二、ACP的比活性分析的比活性分析第10页/共25页 2.各各上清液中上清液中ACP活性测定活性测定 酚酚-4-AAP显色法显色法:以磷酸苯二钠为底物，以磷酸苯二钠为底物，由由ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与催化生成苯酚，在

7、碱性条件下苯酚与4-AAP缩合最终生成红色醌类化合物，缩合最终生成红色醌类化合物，max=510 nm；注意：显色过程中两种缓冲液：注意：显色过程中两种缓冲液：柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供，提供ACP反应条件反应条件 碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件，提供成色反应条件第11页/共25页 3.各各上清液中上清液中ACP比活性分析比活性分析 ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生1nmol酚即酚即nmol/minml为为1个活性单位个活性单位；纯化倍数=各上清液中ACP的比活性上清液I 中ACP的比活性比活性=酶活性 U/m

8、l蛋白质含量mg/ml酶的回收率=各上清液中ACP的活性 总体积上清液I中ACP的活性 总体积还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。第12页/共25页三、三、ACP的动力学分析的动力学分析 1.时间进程（时间进程（t-A）曲线）曲线AACP的的 t-A 曲线曲线时间（t）酚生成量第13页/共25页2.酶浓度酶浓度-速度（速度（E-A）曲线）曲线 酶蛋白含量（E）反应速度VACP 的的 E-V 曲线曲线第14页/共25页 3.pH-酶活性酶活性（pH-V）曲线）曲线pH反应速度V最适pHACP的的pH-酶活性曲线酶活性曲线第15页/共25页1.影响方式：当S较低时，V随S的 增加

9、呈正比例增加 当S较高时，V随S的 增加减慢 当S增大到某一值时，V 达到最大反应速度Vmax2.影响曲线：VSVmax（矩形双曲线）Km4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V）曲线）曲线第16页/共25页曲线方程米-曼氏方程（1）米-曼氏方程：V=VmaxSKm+SV：某一时刻的反应速度S：某一时刻的底物浓度Vmax：反应系统能够达到的最大反应速度Km：米氏常数第17页/共25页 Km和Vmax的测定：双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数得 1 1 1V Vmax S Vmax=+1V 1S纵截距=KmKmVmax斜率=Vmax1横截距=1Km-第18页/共25页1.抑制剂的概念：抑制剂（i

10、nhibitor）：能使酶的催化活性下降而 不引起酶蛋白变性的物质2.抑制作用的分类：抑制作用不可逆性抑制可逆性抑制竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-A）曲线）曲线第19页/共25页 竞争性抑制的动力学变化米-曼氏方程变化为：V=VmaxSKm（1+I/Ki）+S此时，Km增大，Vmax不变1/V1/SE +I EIKi无抑制剂有抑制剂第20页/共25页KH2PO4对ACP 的抑制分析1/V1/S无抑制剂有抑制剂分析抑制类型KH2PO4对ACP 的抑制作用第21页/共25页实 验 安 排1.实验分组2.实验时间安排3.实验内容选择与分工4.实验报告书写第22页/共25页第23页/共25页谢 谢 指 导第24页/共25页感谢您的观看！第25页/共25页