第2章细胞生物学研究方法.pptx

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1、通过上一章的学习，我们知道：工具的改进和方法学上的进步推动着细胞生物学的不断发展。第1页/共55页本章要点：掌握：掌握：1.显微镜的分辨力。(理解公式的含义）理解公式的含义）2.2.光学显微镜与电子显微镜的异同点。（从公式出发理解）（从公式出发理解）3.3.细胞培养。（培养的过程、原代培养与继代培养、单层培养与悬浮（培养的过程、原代培养与继代培养、单层培养与悬浮培养）培养）了解：了解：1.1.细胞组分的分析方法细胞组分的分析方法考试热点：1.细胞培养的几个概念2.光学显微镜的构造第2页/共55页第一节 细胞形态结构的观察方法一、显微结构的观察显微镜是观察细胞显微结构的主要工具，分为两大类：光学

2、显微镜(LightMicroscope)简称光镜电子显微镜(electronmicroscope)简称电镜光学显微镜，包括3部分：照明系统光学放大系统机械装置系统第3页/共55页图示：各种细胞及其组分的大小在对数刻度尺上的分布图及几种显微镜的分辨范围人眼0.2mm光镜0.2m电镜0.2nm线粒体、中心体、核仁1mm=1000m1m=1000nm第4页/共55页（一）普通光学显微镜第5页/共55页图2-11莱卡倒置显微镜第6页/共55页光学显微镜的结构光学显微镜由3部分构成:照明系统：包括光源和聚光器；光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体；机械装置系统：载物台、镜座、粗细调节螺旋第7页

3、/共55页问题：显微镜的观察能力（观察物象的清晰度），仅与显微镜的放大倍数有关？第8页/共55页显微镜下观察的物像是否清晰，除了取决于其放大倍数外，还与显微镜分辨力（resolution，R）有关。分辨力是能分辨物体最小间隔的能力。放大倍数分辨力最关键的因素第9页/共55页分辨力（resolution，R）角物镜聚光镜n表示聚光镜和物镜之间介质的折射率，空气中n为1，香柏油中n为1.5；表示样品对物镜角孔径的半角；表示照明光源的波长，可见光为0.5m。（一）普通光学显微镜n sin=N.A=镜口率第10页/共55页一般来说，一定波长的光源不能用以探查比它本身波长短的结构细节，这是一切显微镜的基

4、本限度。因此，光镜的最高分辨极限（limitresolution）受可见光的波长（0.40.7m）的限制。第11页/共55页细菌和线粒体的长径约0.5m，是光镜下能够观察的最小结构。通常将光镜下所能观察到的细胞结构称为显微结构（microscopicstructure），线粒体、中心体、核仁等可以在光镜下观察到，均属显微结构。第12页/共55页表2-1 几种介质的折射率（n）介质空气水香柏油溴萘折射率11.331.5151.66折射率越接近玻璃的介质越理想光学玻璃的折射率为：1.61.78第13页/共55页（二）相差显微镜相差显微镜是一种可以观察活细胞或未经染色的样本的显微镜。原理：相差显微镜

5、能够改变直射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差（明暗差），同时他还吸收部分直射光线以增大其明暗反差。图2-3相差显微镜的光学原理第14页/共55页（三）微分干涉相差显微镜所采用的光源是偏振光，显微图像边缘没有光晕，分辨率较高、立体感强，有明显的浮雕感。适合观察无色透明的标本（活细胞）。适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。图2-10DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）第15页/共55页（四）暗视野显微镜日常生活中，人们都有这样的体验，由于光的反射和衍射，可在暗处观察到光线斜射时的尘埃，并且尘埃颗粒似乎体积增大；在光线很强或有衍射存在的情况

6、下则看不出尘埃的颗粒。根据此原理，如果使光线不直接通过样品而是斜射到样品上，则可在暗视野下观察到样品的细微粒子。第16页/共55页图2-7 暗视野照明方式暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)使用了特殊的聚光器（通光孔中央有一个圆形遮光板）将照明光源的中央部挡住，使照明光线不能进入物镜和目镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，使被检物体在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使标本反差增大，分辨率提高，可观察到直径4200nm的颗粒，分辨率比普通显微镜提高50倍。第17页/共55页（五）激光共焦扫描显微镜技术由于激光束的波长较短，光束很细，所以激光共焦扫描显微镜有较

7、高的分辨力，大约是普通光镜的3倍。系统一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内；系统多次调焦，即可获得样品不同层次的图像即断层扫描图像。这些图像信息储存于计算机内，通过计算机处理可显示样品的三维立体结构。激光共焦扫描显微镜既可用于观察细胞空间结构，也可用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量观察。第18页/共55页图2-5 激光共聚焦扫描显微镜第19页/共55页（六）荧光显微镜荧光显微技术也许是目前光镜水平对特异蛋白至等生物大分子定性定位的最有力的工具。荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。尼康E-600显微镜第20页/共55页荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1

8、.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图2-3）；2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。图2-3 落射式照明原理第21页/共55页细胞骨架第22页/共55页培养的上皮细胞中的应力纤维（微丝红色、微管绿色）图2-4荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），第23页/共55页多色荧光显微镜第24页/共55页荧光原位杂交技术是用标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的DNA(玻片上的标本)退火杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置来反映相应基因的情况.荧光素直接标记第25页

9、/共55页例：慢性粒细胞白血病CML第26页/共55页与生物学有关的荧光现象：1.自发荧光：通过激发光会使物体发出荧光，如：叶绿素、维生素A等。2.诱发荧光：通过诱导剂作用而发出荧光，如：甲醛蒸汽处理可诱发细胞和组织中生物单胺类产生荧光。3.荧光染料染色荧光：如：吖啶橙可以对细胞DNA、RNA同时染色，显示不同颜色的荧光。第27页/共55页二、超微结构的观察1932年德国学者Knolls和Ruska发明了第一台电子显微镜，电镜用波长比可见光波长短100,000倍的电子束代替光波，大大提高了显微镜的分辨率。在电镜下才能观察到的结构称为亚显微结构（submicroscopicstructures）

10、或超微结构（ultramicroscopicstructures；ultrastructures）第28页/共55页图2-12JEM-1011透射电子显微镜图2-14内质网透射电镜图（伪彩色）第29页/共55页 电镜与光镜的基本区别分辨力光源透镜真空光镜200(油镜)300nm可见光玻璃透镜 不需真空电镜0.1nm电子束电磁透镜 真空第30页/共55页（一）透射电子显微镜透射电镜(transmissionelectronmicroscope，TEM)是用电子枪发射的高速电子束(电子流)代替光镜照明的光线，用特殊的电极或磁极(静电透镜和磁透镜)代替光镜的聚光镜、目镜和物镜，从而达到聚焦和放大目的

11、(图2-4)。图2-4光镜与电镜的比较第31页/共55页（二）扫描电子显微镜扫描电镜原理是，用一束极细的电子束扫描样品，激发样品表面释放出次级电子；次级电子由探测器收集并转变成光信号，经光电倍增管和放大器转变成电压信号并控制荧光屏上电子束的强度；电子束强度反映在荧光屏上即为相应部位亮或暗的差异。图2-5 扫描电镜的光学系统第32页/共55页电镜的样品制备1超薄切片技术制作超薄切片:固定包埋切片染色2负染色技术:所谓负染色技术是染背景而不是染样品的方法。主要过程是，用重金属盐（如磷钨酸钠）对铺展在载网上的样品染色，样品经干燥后，整个载网都铺上一层重金属盐，有凸出颗粒的地方没有染料沉积，在图像中背

12、景是黑暗的；而未被包理的样品颗粒则透明光亮，从而衬托出样品的精细结构，出现负染效果。第33页/共55页图2-6 肌动蛋白纤维的负染电镜照片第34页/共55页3.冷冻蚀刻技术冷冻蚀刻（freeze-etching）技术是在冷冻断裂技术基础上发展起来的更复杂的复型技术。将冷冻断裂的细胞膜样品的温度稍微升高，让样品中的冰在真空中升华，则细胞膜表面显示出浮雕样结构，对浮雕表面进行铂一碳复型，并在腐蚀性溶液中除去生物材料，复型经重蒸水多次清洗后，捞在铜网上即可进行电镜观察(图2-7)。第35页/共55页图2-7冰冻断裂与冰冻蚀刻技术P面E面第36页/共55页图2-16冰冻蚀刻电镜照片第37页/共55页第

13、二节 细胞组分的分析方法一、离心技术离心是研究细胞器如细胞核、线粒体、高尔基复合体、溶酶体和过氧化物酶体及各种大分子的基本手段。离心机：高速离心机，超速离心机。细胞结构成分离心的方法有两类：差速离心和密度梯度离心。第38页/共55页离心机第39页/共55页差速离心（differential differential centrifugationcentrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。图2-22速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀（一）差速离心第40页/共55页（二）、密度梯度离心图2-23A速度沉降，B等密度沉降用一定的介质在离心管内形

14、成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种（图2-23）。第41页/共55页二、免疫细胞化学法二、免疫细胞化学法免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。结合上标记物的抗体与组织中的抗原反应，可在光镜或电镜下显示出该抗原所在组织中的位置。第42页/共55页三、放射自显影三、放射自显影放射自显影术（radioautography；autoradiography）的原理是，将放射性同位素（如14C和3H）标

15、记的化合物导入生物体内；经过一段时间后，取材制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶；经一定时间的放射性曝光，带有放射性物质的组织结构使乳胶感光；经显影、定影处理，即可观察到相应的组织结构。第43页/共55页3 3 3 3H H H H标记亮氨酸标记亮氨酸标记亮氨酸标记亮氨酸3 3 3 3分钟分钟分钟分钟17171717分钟分钟分钟分钟117117117117分钟分钟分钟分钟例如：细胞的分泌第44页/共55页四、四、流式细胞术流式细胞术流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。图2-8用流式细胞计分选细胞第45页/共55页第三节 细胞培养一、细胞培养的主要步骤 准备：取材：在无菌环境下，从

16、机体取出某种组织，经过消化分散细胞、分离等处理的过程称为取材。细胞株的扩大培养无取材环节。培养：将取得的组织细胞接种入培养瓶或培养板的过程称为培养。第46页/共55页实验准备实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管第47页/共55页培养细胞生长的条件1细胞的营养需要2细胞的生存环境温度:37O2CO2:5%CO2+H2OH2CO3H+HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒第48页/共55页二、原代培养和继代培养1.原代培养n取自体内新鲜组织并置

17、于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。2.继代培养：n细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。3.名词：细胞系（有限细胞系、无限细胞系）、细胞株第49页/共55页图2-9 细胞原代培养第50页/共55页三、单层培养与悬浮培养三、单层培养与悬浮培养1 1单层培养（贴壁培养）大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞。这类细胞悬浮在培养瓶中很快(几十分钟至几小时)就贴附在瓶壁上；2 2悬浮培养 某些类型的癌细胞、淋巴细胞及白血病细胞常用悬浮培养的方法。悬浮培养的细胞在培养过程中不贴壁，一直悬浮在培养液中生长。图2-25群体培养（左）和克隆培养（右）第51页/共55页细胞

18、培养名词1原代培养与继代培养：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或继代培养（Passage）。2细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。3细胞系（cellline）：原代培养的组织细胞首次传代成功后繁殖的细胞群体称谓细胞系。4单层培养与悬浮培养第52页/共55页思考题?1、显微镜的分辨率？2、电镜与光镜的基本区别3、名词：原代培养、继代培养、细胞株、细胞系、密度梯度离心、差速离心。4、了解荧光原位杂交技术的原理。第53页/共55页谢谢同学们！第54页/共55页感谢您的观看！第55页/共55页