凝胶层析分离技术.pptx
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1、会计学1凝胶层析分离技术凝胶层析分离技术第十章第十章第十章第十章 凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析法凝胶层析法第一节凝胶的条件和类型第一节凝胶的条件和类型第一节凝胶的条件和类型第一节凝胶的条件和类型第二节基本原理第二节基本原理第二节基本原理第二节基本原理第三节第三节第三节第三节 凝胶层析的实验技术凝胶层析的实验技术凝胶层析的实验技术凝胶层析的实验技术 第四节第四节第四节第四节 凝胶层析的应用凝胶层析的应用凝胶层析的应用凝胶层析的应用第1页/共43页第一节第一节 凝胶的条件凝胶的条件和类型和类型n n层析凝胶必须具备下列条件:层析凝胶必须具备下列条件:层析凝胶必须具备下列条件:层析凝胶必须具备下列条
2、件:n n凝胶层析中常用凝胶类型凝胶层析中常用凝胶类型凝胶层析中常用凝胶类型凝胶层析中常用凝胶类型第2页/共43页层析凝胶必须具备下列条件层析凝胶必须具备下列条件1.1.1.1.凝胶必须是化学惰性的凝胶必须是化学惰性的 2.2.2.2.凝胶的化学性质必须是稳定凝胶的化学性质必须是稳定的的 3.3.3.3.凝胶上没有或只有极少量的凝胶上没有或只有极少量的离子基团离子基团4.4.4.4.凝胶必须具有足够的机械强凝胶必须具有足够的机械强度度 第3页/共43页凝胶层析中常用凝胶凝胶层析中常用凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(dextran geldextran geldextran gel
3、dextran gel,SephadexSephadexSephadexSephadex)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gelpolyacrylamide gelpolyacrylamide gelpolyacrylamide gel,Bio-Gel PBio-Gel PBio-Gel PBio-Gel P)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(agarose gelagarose gelagarose gelagarose gel,SepharoseSepharoseSepharoseSepharose)琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝
4、胶琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(SuperdexSuperdexSuperdexSuperdex)第4页/共43页葡聚糖凝胶部分结构葡聚糖凝胶部分结构葡聚糖凝胶部分结构葡聚糖凝胶部分结构葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶部部部部分分分分结结结结构构构构(Sephadex)第5页/共43页聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶的的部部分分结结构构(Bio-Gel P)第6页/共43页琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶(Sepharose)(Sepharose)(Sepharose)(
5、Sepharose)(Sepharose)琼脂糖凝胶的部分结构第7页/共43页第二节第二节第二节第二节 基基基基 本本本本 原原原原 理理理理 一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应 二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积三、分配系数(三、分配系数(三、分配系数(三、分配系数(KdKdKdKd)四、有效分配系数(四、有效分配系数(四、有效分配系数(四、有效分配系数(KavKavKavKav)五、分子量与五、分子量与五、分子量与五、分子量与Ve Ve Ve Ve 的关系的关系的关系的关系第8页/共43页
6、一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应一、凝胶的结构与分子筛效应 动画演示第9页/共43页二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积二、凝胶床总体积 Vt Vt :柱床柱床“总容积总容积”,VoVo:即存在于柱床内凝:即存在于柱床内凝 胶颗粒外面空隙之间的胶颗粒外面空隙之间的 水相容积水相容积 ViVi:即凝胶颗粒内部所:即凝胶颗粒内部所 含水相的容积。含水相的容积。VgVg:凝胶本身的容积;:凝胶本身的容积;VtVo十十Vi十十Vg 或或 Vt-Vo=Vi十十Vg,第10页/共43页三、分配系数(三、分配系数(三、分配系数(三、分配系数(K K
7、K Kd d d d)0Kd1,Ve在在Vo与与Vo十十Vi之间变化之间变化VeVe:为实际测得的洗:为实际测得的洗脱容积,自样品加入脱容积,自样品加入到组分最大浓度到组分最大浓度(峰峰)出出现时所流出的容积;现时所流出的容积;VeVo十十KdVi第11页/共43页四、有效分配系数(四、有效分配系数(四、有效分配系数(四、有效分配系数(K K K Keffeffeffeff)将将Vt-VoVt-Vo代替代替ViVi,则:,则:即:即:VeVeVoVo十十K Keffeff(Vt-Vo)(Vt-Vo)实际上,实际上,KKeff是是将以水作为固定相将以水作为固定相(Vi)(Vi)改为水与凝胶颗粒改
8、为水与凝胶颗粒(Vt-Vo)(Vt-Vo)作为固定相,作为固定相,而洗脱剂而洗脱剂(Ve-Vo)(Ve-Vo)为流动相。为流动相。KavKav与与KdKd对交联度小的凝胶差别较小,而对对交联度小的凝胶差别较小,而对交联度大的凝胶差别大。交联度大的凝胶差别大。在一般情况下,凝胶对组分没有吸附作用时,当流动相流过在一般情况下,凝胶对组分没有吸附作用时,当流动相流过VtVt体积体积后,所有的组分都应该被洗出来,这一点为凝胶层析法的特点,后,所有的组分都应该被洗出来,这一点为凝胶层析法的特点,第12页/共43页五、五、五、五、VeVeVeVe与相对分子量的关系与相对分子量的关系与相对分子量的关系与相对
9、分子量的关系 Ve=KVe=K1 1-K-K2 2lgM lgM K K K K1 1 1 1、K K K K2 2 2 2为常数,为常数,为常数,为常数,VeVeVeVe可用如下表可用如下表可用如下表可用如下表达式代替,达式代替,达式代替,达式代替,Ve-VoVe-VoVe-VoVe-Vo(分离体积),(分离体积),(分离体积),(分离体积),Ve/VoVe/VoVe/VoVe/Vo(相对保留体积),(相对保留体积),(相对保留体积),(相对保留体积),Ve/VtVe/VtVe/VtVe/Vt(简化洗脱体积),(简化洗脱体积),(简化洗脱体积),(简化洗脱体积),K K K Keffeffe
10、ffeff(相对洗脱体积)(相对洗脱体积)(相对洗脱体积)(相对洗脱体积)在不同型号凝胶上蛋在不同型号凝胶上蛋在不同型号凝胶上蛋在不同型号凝胶上蛋白质的选择曲线的白质的选择曲线的白质的选择曲线的白质的选择曲线的差异差异差异差异第13页/共43页第三节第三节 凝胶层析的操凝胶层析的操作技术作技术一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理一、凝胶的选择与处理二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱 四、实验操作四、实验操作四、实验操作四、实验操作五、凝胶柱的保养和凝胶的保存五、凝胶柱的
11、保养和凝胶的保存五、凝胶柱的保养和凝胶的保存五、凝胶柱的保养和凝胶的保存 第14页/共43页一、凝胶的选择一、凝胶的选择 n n排阻范围与粒度的选排阻范围与粒度的选择择n n凝胶用量的计算凝胶用量的计算第15页/共43页排阻范围的选择排阻范围的选择第16页/共43页粒度的选择粒度的选择粒粒度度的的选选择择第17页/共43页凝胶用量的计算凝胶用量的计算凝胶用量的计算凝胶用量的计算干凝胶用量(干凝胶用量(干凝胶用量(干凝胶用量(g g g g):):):):rrrr2 2 2 2h/h/h/h/膨胀度膨胀度膨胀度膨胀度 (膨胀度:(膨胀度:(膨胀度:(膨胀度:床体积床体积床体积床体积/克干胶)克干
12、胶)克干胶)克干胶)理论用量理论用量理论用量理论用量(1+10%1+10%1+10%1+10%)凝胶的处理)凝胶的处理)凝胶的处理)凝胶的处理SephadexSephadexG-25G-25G-75G-75G100G100G-150G-150G-200G-200(中)湿球粒度(中)湿球粒度(中)湿球粒度(中)湿球粒度 mm100-100-200200120-120-20020020-20-200200120-120-200200120-120-200200吸水值吸水值吸水值吸水值 ml/gml/g干胶干胶干胶干胶2.50.2.50.2 27.50.7.50.5 510.01.10.01.0 0
13、15.01.15.01.5 520.02.20.02.0 0床体积床体积床体积床体积 ml/gml/g干胶干胶干胶干胶4-64-612-1512-1515-2015-2020-3020-3030-4030-40球蛋白分离范围球蛋白分离范围球蛋白分离范围球蛋白分离范围 KDKD1-51-53-803-804-1504-1505-3005-3005-6005-600第18页/共43页二、凝胶装拄制备二、凝胶装拄制备1.1.1.1.柱结构(柱结构(、h h)的)的选择选择2.2.2.2.装柱装柱3.3.3.3.柱鉴定柱鉴定第19页/共43页柱结构(柱结构(柱结构(柱结构(、h h h h)的选择)的
14、选择)的选择)的选择第20页/共43页三、样品上柱及洗脱三、样品上柱及洗脱n n加样量的控制加样量的控制 分析:分析:分析:分析:1-2ml/100ml1-2ml/100ml1-2ml/100ml1-2ml/100ml床体积床体积床体积床体积 制备:制备:制备:制备:10-30ml/100ml10-30ml/100ml10-30ml/100ml10-30ml/100ml床体积床体积床体积床体积n n洗脱液的选择洗脱液的选择 控制凝胶收缩控制凝胶收缩控制凝胶收缩控制凝胶收缩n n影响洗脱的影响洗脱的因素因素 流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨
15、率的影响 操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系第21页/共43页流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响流速对蛋白质分辨率的影响第22页/共43页黏度对分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏度对分辨率的影响黏黏度度对对分分辨辨率率的的影影响响第23页/共43页凝胶柱层析操作压凝胶柱层析操作压凝胶柱层析操作压凝胶柱层析操作压第24页/共43页操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系操作压与流速的关系第25页/共43页加样量对分辨率的影响加样量对分辨率的影响加样量对分辨率的影响加样量对分辨率的影响 I.I
16、.加养量少时,加养量少时,A A、B B二种物质充二种物质充全分开。全分开。II.II.加养量适当加养量适当时,时,A A、B B 二种物二种物质刚刚分开。质刚刚分开。III.III.加养量太大加养量太大时,时,A A、B B二种物二种物质只能部分分开。质只能部分分开。第26页/共43页四、四、四、四、凝胶层析的操作技术凝胶层析的操作技术凝胶层析的操作技术凝胶层析的操作技术1.1.1.1.凝胶的凝胶的凝胶的凝胶的处理处理处理处理2.2.2.2.柱层析系统的柱层析系统的柱层析系统的柱层析系统的安装安装安装安装3.3.3.3.凝胶凝胶凝胶凝胶装拄装拄装拄装拄4.4.4.4.样品样品样品样品上柱及洗
17、脱上柱及洗脱上柱及洗脱上柱及洗脱 5.5.5.5.VoVoVoVo、ViViViVi、VtVtVtVt的的的的测定测定测定测定6.6.6.6.标准曲线的制作及标准曲线的制作及标准曲线的制作及标准曲线的制作及KdKdKdKd和和和和KavKavKavKav的的的的计算计算计算计算7.7.7.7.凝胶柱的保养和凝胶的凝胶柱的保养和凝胶的凝胶柱的保养和凝胶的凝胶柱的保养和凝胶的保存保存保存保存 第27页/共43页1 1 1 1、凝胶的处理、凝胶的处理、凝胶的处理、凝胶的处理 将称好的干粉倾人过量将称好的干粉倾人过量将称好的干粉倾人过量将称好的干粉倾人过量的洗脱液中,室温下充分溶胀。的洗脱液中,室温下
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