蛋白组学二维电泳.pptx

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1、第二章第二章 二维电泳与蛋白质分二维电泳与蛋白质分离离一、蛋白质的提取与样品制备二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三、胶上蛋白质检测技术第1页/共82页一、蛋白质的提取与样品制备从生物材料中获得所需蛋白质样品的过程意义蛋白质组分析的基础，也是研究工作第一步制备的完整性、纯度、浓度对下面分析非常重要无完全通用技术（技术和大量经验的结合）包括分离、提取、纯化（分开、结合、省略）分离：生物样品提取液中的蛋白质与其它大量杂质分开提取：将已经与其它物质分开的蛋白质提取出来（如沉淀等）纯化：对提取的蛋白质进一步清除杂质成为纯度高的蛋白质样品（如亲和纯化等）第2页/共82页二维电泳分析中的样品制备

2、（目标蛋白在细胞中的存在方式）稳定性（热、pH、蛋白酶、化学试剂等）丰度定位（膜、细胞质、细胞器等）溶解性（可溶、微溶、难溶、不溶）分离难易程度制备变性、活性蛋白第3页/共82页二维电泳分析中的样品制备制备原则：尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白质损失。（1）明确研究目标，获得尽可能多的感兴趣蛋白。（2）不同类型的蛋白质需要不同的方法（3）考虑目标蛋白性质，细胞破碎选择温和和激烈两种方法应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品（特别是溶解性低的蛋白如膜蛋白）在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品降解（如酶性或

3、化学性降解等）。防止发生化学修饰（加入尿素之后，加温不要超过37C，以防蛋白质氨甲酰化）。第4页/共82页破坏蛋白质与其它大分子之间的相互作用，形成线性、独立的肽链样品裂解液新鲜制备，并且分装冻存于-80C，不要反复冻融样品。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。通过超速离心清除所有的杂质。主要去除盐、小分子化合物、脂类、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。第5页/共82页蛋白质制备流程分离、提取、纯化分离：组织或细胞破碎最大程度的细胞破碎最小程度的蛋白水解或降解提取：分离或沉淀蛋白质（可选择）去除杂质（除盐、小分子化合物、脂类

4、、离子去污剂、核酸、多糖、脂类、酚类等）冷冻干燥、沉淀（TCA、丙酮）等纯化：去除无关杂质（可选择）反复提取分级提取第6页/共82页样品类型整体样品：单细胞微生物、微生物混合菌等组织样品：器官（肝脏）、植物组织（根、叶）等细胞（细胞器）样品：培养细胞、分离细胞、细胞核、线粒体等可溶性样品：血清、尿液等第7页/共82页细胞裂解的方法1、温和裂解的方法:裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。细胞破碎方法细胞破碎方法 应用对象应用对象 操作步骤操作步骤 渗透溶胞法渗透溶胞法非非常常温温和和的的裂裂解解方

5、方法法，可可用用于于进进一一步步进行亚细胞分级。进行亚细胞分级。血血细细胞胞、组组织织培培养养细细胞胞 将将细细胞胞悬悬浮浮于于渗渗透透溶溶胞胞溶溶液液中中，细细胞胞溶溶胀胀而而释释放放出出细胞内容物细胞内容物冻融裂解冻融裂解许许多多类类型型的的细细胞胞可可以以通通过过快快速速反反复复冻冻融得到裂解。融得到裂解。细细菌菌细细胞胞、组组织织培培养养细胞细胞 使使用用液液氮氮，快快速速反反复复冻冻融融至符合实验要求为止。至符合实验要求为止。裂解液裂解裂解液裂解含含去去污污剂剂的的裂裂解解液液处处理理组组织织、细细胞胞以以裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。裂解细胞膜，使细胞内容物释放出来。组织培养细

6、胞组织培养细胞将将细细胞胞直直接接置置裂裂解解液液或或样样品液中，进行悬浮处理。品液中，进行悬浮处理。酶裂解酶裂解有有细细胞胞壁壁的的细细胞胞可可以以通通过过酶酶解解去去除除细细胞壁得以温和裂解胞壁得以温和裂解植植物物细细胞胞、细细菌菌细细胞胞、真菌细胞真菌细胞 将将细细胞胞悬悬浮浮于于专专一一性性酶酶的的等渗溶液中。等渗溶液中。第8页/共82页2、剧烈的细胞裂解方法:破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞细胞破碎方法细胞破碎方法 应用对象应用对象 操作步骤操作步骤 超声波处理超声波处理超超声声波波产产生生剪剪切切力力使使细细胞胞破碎破碎 悬浮细胞悬浮细胞要要进进行行间间歇

7、歇处处理理，减减轻轻产产生生热热和和泡泡沫沫，样样品品处处理理应应在在冰冰浴浴中中进行进行 压力杯法（压力杯法（French Press）用用高高压压使使细细胞胞穿穿过过小小孔孔，产生剪切力从而撕破细胞产生剪切力从而撕破细胞 微微生生物物细细胞胞，如如细细菌菌、霉霉菌菌、酵酵母母细细胞胞及及含含有有细细胞胞壁壁的的细胞细胞 将将细细胞胞悬悬浮浮液液置置于于预预冷冷的的压压力力杯杯中中，施施加加压压力力，然然后后收收集集挤挤出液出液 研磨法研磨法 固固体体组组织织细细胞胞、微微生物细胞生物细胞 组组织织或或细细胞胞预预先先用用液液氮氮冷冷冻冻，然后置瓷研钵中研磨成粉末。然后置瓷研钵中研磨成粉末。

8、加氧化铝或砂有助于研磨加氧化铝或砂有助于研磨 机械匀浆法机械匀浆法（防防止止细细胞胞破破碎碎释释放放出出蛋蛋白酶，引起蛋白质修饰）白酶，引起蛋白质修饰）固固体体组组织织，如如心心脏脏、肝肝脏脏、肾肾脏脏组组织织和和细菌悬液细菌悬液 先先尽尽量量将将组组织织剪剪成成小小块块，然然后后加加有有蛋蛋白白酶酶抑抑制制剂剂的的冷冷匀匀浆浆液液进行匀浆，过滤或离心收集。进行匀浆，过滤或离心收集。第9页/共82页蛋白质的分离与提取方法硫酸铵沉淀高盐溶液中，蛋白倾向聚集沉淀；但很多蛋白即使在高盐中也可溶搅拌情况下，缓慢滴加(NH4)2SO4到饱和，离心分离蛋白三氯乙酸沉淀10-20即可沉淀蛋白；再溶解困难丙酮

9、沉淀常用方法加入3倍以上体积丙酮，-20 C沉淀2h以上，离心分离蛋白三氯乙酸丙酮沉淀同时加入三氯乙酸和丙酮，-20 C沉淀，离心分离蛋白；再溶解困难苯酚提取甲醇中乙酸铵沉淀饱和酚提取蛋白，甲醇中用NH4Ac沉淀蛋白，依次用NH4Ac和丙酮洗涤沉淀第10页/共82页裂解液的组成目的：加入裂解液主要是确保一向等电聚焦之前样品的完全溶解和变性组成：IPG缓冲液（IPG buffer）：Tris等离液剂（Chaotropic Agents）：硫脲和尿素 去污剂（Detergents）：SDS、TritonX-100、NP-40、CHAPS等还原剂（Reducing Agents）：-巯基乙醇、DTT

10、或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等两性电解质（Carrier ampholytes）蛋白酶抑制剂（protease inhibitors）：PMSF等第11页/共82页离液剂（Chaotropic Agents）尿素是最常用的离液剂，2mol/L硫脲和5-8mol/L尿素联合使用（硫脲在水中的溶解性很差）原理：NH2-CO-NH2,NH2-CS-NH2 改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活破坏了疏水键（防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性）硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性 使用注意点：样

11、品离心前在室温下至少保持1小时，使完全变性和溶解；样品含尿素不可加热，防蛋白修饰；样品类型不同，选择裂解液的组成也不同第12页/共82页去污剂（Detergents）破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。类型：离子型：SDS等非离子型：TritonX-100、NP-40等兼性离子型：CHAPS(3-(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-propane sulfonate)、ASB-14(Amidosulfobetaine 14)等使用注意：原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的

12、等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦。SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。CHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，然而在高浓度脲中的溶解度比较低第13页/共82页还原剂（Reducing Agents）断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的还原剂有-巯基乙醇、DTT或TDF（二硫赤藓糖）和三丁基膦(TBP)等。DTT是使用比较广泛的还原剂。50mmol/L时能有效地还原大部分的二硫键 使用注意点：DTT的pKa在8左右，如果过分提高DTT的浓度会

13、影响到pH梯度。DTT在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足。导致二硫键复原，蛋白质沉淀。非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。第14页/共82页两性电解质（Carrier ampholytes）防止蛋白质过早沉淀在它们的等电点附近，促进蛋白质的溶解。在第一向等电聚焦时，提高极性端蛋白质的聚焦效果。吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子。离心时还有助于核酸的沉淀。阻止样品蛋白质和IPG 胶条中固相化的两性电解质相互作用。第15页/共82页两性电解质对蛋白溶解性和2-DE分辨率的影响

14、pI 3.5 pI 9.5 pI 3.5 pI 9.5A：0.5两性电解质 B：2.0两性电解质 第16页/共82页蛋白酶抑制剂防止蛋白酶裂解防止细胞裂解时蛋白酶释放出来降解蛋白质。低温、pH9的裂解液可降低蛋白酶活性，但不能真正消除，故得加酶抑制剂（以下一种或数种的混合物）（1）PMSF：苯甲磺酰氟，工作浓度1M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但在水溶液中失活。（2）AEBSF：可在水溶液中使用，工作浓度4M，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶，但可能改变蛋白质的等电点。（3）EDTA、EGTA：乙二氨四乙酸和乙二醇双四乙酸的工作浓度为1M，作用对象为金属蛋白酶。第17页/

15、共82页（4）肽蛋白酶抑制剂：价格贵，本身会出现二维电泳图中。亮抑酶肽：在DDT中可逆抑制丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。胃蛋白酶抑制剂A：作用对象为天冬氨酸蛋白酶。抑蛋白酶A肽：作用对象为丝氨酸蛋白酶。苯丁抑制素：作用对象为氨基蛋白酶。（5）TLCK、TPCK：甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮、甲苯磺酰苯氨酰氯甲酮的工作浓度为0.1-0.15mM，能不可逆灭活丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶。第18页/共82页清除影响二维电泳图谱的杂质（1）盐、残留的缓冲液和电性小分子盐等带电物质会干扰电泳过程、增大溶液电导率，通常用透析、凝胶过滤、沉淀/重悬的方法脱盐，但易使样品丢失。（2）内源性小分子这些物质通常带负电，

16、使阳极侧的聚焦不全，可采用丙酮/TCA沉淀去除。（3）离子去污剂SDS等离子去污剂，易和多肽形成复合物而干扰IEF，-200C的丙酮溶液可除去。第19页/共82页（4）核酸核酸增加样品黏度，导致二维电泳背景发散；能与蛋白质结合，阻碍聚焦；银染时出现高背景。加0.1V的核酸酶溶液(1mg/ml DNAase+0.25 mg/ml RNAase+50mM MgCl2)冰上孵育，但要注意核酸酶本身会出现在图谱中。（5）多糖多糖能阻碍凝胶孔径、与蛋白质形成复合物、延长聚焦时间、可能出现水平条纹，可用(NH4)2SO4或苯酚-NH4Ac沉淀后离心，或用超速离心去多糖。（6）脂类脂类易和膜蛋白结合成复合物

17、，改变蛋白溶解性、等电点和分子量，采用大量去污剂可除去。（7）酚类通常出现在植物组织中，通过氧化反应修饰蛋白质，可加还原剂抑制氧化，也可用沉淀法去除，或加抑制剂灭活多酚氧化酶。第20页/共82页蛋白质的分级提取在2-DE胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白质的拷贝数、蛋白质的溶解性、蛋白质的上样量及电泳后染色方法的灵敏度。为了能够富集低拷贝蛋白质，采用了样品预分级的方法，如亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶解性的顺序提取法等。应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得1000-2000个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，对不同组分进行分离，据报道能够获得

18、上万个不同的蛋白质点。主要分步提取策略：蛋白质溶解度蛋白质细胞定位蛋白质亲和力 第21页/共82页分步提取法（溶解性差异）1998年 Molley提出结合高效裂解液分步溶解的技术路线:1、水溶液提取，溶解亲水性蛋白质 5-15mg细胞+2ml裂解液I（40mM Tris）反复冻融3-4循环加适量DNase I和 RNase A震荡混均、离心收集上清（沉淀留下一步）、冷冻干燥，得提取物I。2、含Urea/CHAPS/DTT溶液的提取，溶解亲水性、中性和疏水性蛋白 第一步沉淀物+50l 裂解液II剧烈震荡混均，离心收集上清（沉淀留下一步），得提取物II。裂解液II：8 M Urea(解聚剂)、4%

19、CHAPS(表面活性剂)、100mM DTT(还原剂)、40mM Tris、0.5%Pharmalyte3-10、20 g/ml DNase I、5 g/ml RNase A第22页/共82页3、含硫脲/SB3-10/TBP溶液的提取，溶解疏水性蛋白 第二步沉淀物40mM Tris清洗200l 裂解液III 溶解剧烈震荡混均，离心收集上清，保存于-70。裂解液III：5 M Urea、2 M Thiourea(解聚剂)、2%CHAPS、2%SB3-10(表面活性剂)、2mM TBP(还原剂)、40mM Tris、0.5%Pharmalyte3-10、20 g/ml DNase I、5 g/ml

20、 RNase A。对大部分细胞提取，第一步与第二步往往出现相同的图谱，最后一步因膜蛋白提取出来而完全不同。若先将细胞器分级提取，再联合上述方法，效果将更好。第23页/共82页第24页/共82页ReadyPrep Sequential Extraction Kit（BioRad公司）SAMPLEResidue 1Solution 1，50mlTris,pH 9.5SupernatantResidue 2Solution 2，10mlUrea/CHAPS/TrisBio-Lyte/TBPResidue 3Solution 3，10mlUrea/thiourea/CHAPS/SB3-10 Tris/

21、Bio-Lyte/TBP4080%1249%58%1%6%SupernatantSupernatant第25页/共82页亚细胞器蛋白质的提取1 1、细胞中亚细胞器的分离 据亚细胞器的大小、形状、密度的差异，利用差速离心和密度梯度离心进行分离。细胞破碎后，先低速离心从胞质溶液中分离出细胞核和未破碎的细胞，得到上清溶液；随后对上清溶液进行密度梯度分离，得到线粒体、溶酶体等亚细胞器；然后对亚细胞内的蛋白质进行分离提取。第26页/共82页差速离心在密度均一的介质中不同颗粒大小的物质在不同的离心力作用下沉降而分离不同细胞器有不同的大小和沉降特性第27页/共82页不同细胞器的大小和沉降特性第28页/共82

22、页差速离心差速离心形成的沉淀（肝脏）第29页/共82页密度梯度离心用一定的介质在离心管中形成连续或不连续的梯度，通过一定的离心力的作用使得细胞器进行分层分离。1.速度沉降：密度相近但大小不等2.等密度沉降平衡：密度不等的物质第30页/共82页1、速度沉降生物颗粒在一定的密度梯度介质中按照各自的沉降系数（S）以不同的速度沉降。必须在沉降最快的生物颗粒到达管底前停止沉降，并将各部分收集通常在密度较低的介质中进行，一般不需要高速离心牛血清、Ficoll（聚蔗糖）、白蛋白等第31页/共82页2、等密度沉降平衡生物颗粒的在连续或不连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间沉降到与其自身密度相等的介质处，

23、并停留在该处达到平衡，从而将不同密度的生物颗粒分离。介质密度较高，介质的最高密度大于分离组分的最大密度，密度具有一定的陡度离心力比较大，离心时间长Ficoll、Percoll（细胞分离液）、Metrizamide（甲泛葡胺）等第32页/共82页纯化不同细胞器所推荐的梯度和离心条件 缩写：(NUC)细胞核；(PMS)大片细胞膜；(MTT)线粒体；(LYS)溶酶体；(PER)过氧化物酶体；(PMV)细胞膜小泡；(SER)滑面内质网；(RER)粗面内质网；(END)核内体；(SARCRT)肌质网；(NUCMB)核膜；(OUTER MITMB)线粒体外膜；(INNER MITMB)线粒体内膜；(HOM

24、)匀浆物；(dc)非连续；(c)连续。第33页/共82页特殊细胞器的提取1、膜蛋白的提取（1）膜蛋白的定义：与膜相关的蛋白，如脂双分子层嵌入蛋白，也叫跨膜蛋白。膜蛋白占细胞总蛋白约30%，在细胞生命活动中起重要作用（如信号蛋白、黏附蛋白、载体蛋白），许多膜蛋白是药物作用靶标。第34页/共82页（2）膜蛋白提取注意点A、膜蛋白的纯度与膜粘连的细胞器可能部分分离出来造成假性，故用KBr溶液或用更多的离液剂进行清洗，可去掉与膜作用不强的非膜蛋白，从而富集膜蛋白。另外膜蛋白通常位于两相去污系统中相对较丰富的一相。B、膜蛋白的特性低丰度、大多偏碱性、难溶于等电聚焦的水相介质中。C、为了从二维电泳凝胶图谱

25、中分离出膜蛋白，首先必须服从三个条件a、必须保证膜的脂类环境，同时要避免过多的脂对IEF的干扰。b、必须以一种可溶的形式（通常是去污剂-蛋白复合物）从膜中分离出来。c、所提取的膜蛋白必须在等电聚焦过程中（特别在等电点附近）保持可溶状态。新的去污剂、对疏水蛋白强溶解的裂解液使膜蛋白提取进一步完善，毫克级上样量的二维电泳设备提高了分离的可靠性。第35页/共82页2、核蛋白的提取（1）核基质的提取 A、核基质定义：非染色体结构蛋白及细胞核径向高盐离子、核酸酶、去污剂抽提所剩的核蛋白网上结构，包括核纤维蛋白、低丰度核蛋白、核内核糖核蛋白及DNA结合区。B、提取步骤：细胞核在含0.5%Triton100

26、和1.2mM蛋白抑制剂的缓冲溶液中匀浆数分钟 离心去脂类和可溶性蛋白 取沉淀,与提取液4反应15min 离心除可溶性骨架蛋白取沉淀在消化液内室温消化30min 离心得核基质蛋白和中间丝 再溶于含8M尿素的裂解液中 透析除尿素 离心得上清夜即为细胞核基质蛋白。提取液：100mM KCl+3mM MgCl2+0.5%TritonX-100+12mM PMSF 消化液：50mM NaCl+3mM MgCl2+100g/ml DNase I+100g/ml RNase A。第36页/共82页（2）核膜蛋白的提取A、提取方法：核膜蛋白包括膜整合蛋白和多蛋白复合物，不能用去污剂提取，通常用分级制备法得到：

27、细胞核用冰TP缓冲溶液匀浆4下搅拌90min、离心（1000g）30min 取沉淀用STM0.25 缓冲溶液重悬即得核膜蛋白提取液。B、进一步分级提取：核膜蛋白提取液+TritonX-100（终浓度0.5%）或 NaCl（终浓度1M）或 Urea（终浓度4M）4震荡15min 13000rpm离心可得TX抗性蛋白及NaCl洗脱蛋白 50000rpm离心可得离液剂抗性物质 C、常用溶液 TP缓冲溶液：10mM Tris-HCl pH7.4+10mM NaH2PO4+1mM PMSF+10 g/ml aprotinin+10g/ml leupeptin+250 g/ml heparin+1mM N

28、a3VO4+10mM NaF+400U Benzon uclease STM0.25 缓冲溶液:20mM Tris-HCl pH7.4+0.25M Sucrose+5mM MgSO4+1mM Na3VO4+1mM PMSF+g/ml aprotinin+10g/ml leupeptin第37页/共82页第二章第二章 二维电泳与蛋白质分二维电泳与蛋白质分离离一、蛋白质的提取与样品制备二、二维等电聚焦-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳维等电聚焦电泳三、胶上蛋白质检测技术第38页/共82页电泳的概念带电颗粒在一定的介质中，在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。影响电泳速度的主要因素：电场强度（

29、E）：E越高，电泳速度越快溶液的pH值：pI和pH相差越多，带电越多，电泳速度越快溶液的离子强度（I）：I越高，样品电流越小，电泳速度越慢；I过低，可导致pH局部变化影响电泳速度电渗：介质局部电离导致的样品电泳速度改变焦耳热（Q）：热量高，促使溶液挥发；同时使得电流降低导致电泳速度减慢第39页/共82页生物实验室常用电泳支持物分类滤纸及纤维膜等：玻璃纤维、醋酸纤维等凝胶：琼脂（agarose）、聚丙烯酰胺凝胶（PAG）等装置分类平板式垂直板式圆盘式pH连续性分类连续pH非连续pH：如等电聚焦电泳第40页/共82页聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophore

30、sis,PAGE）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAG）由单体丙烯酰胺（acrylamide，Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N，N-methylenebisacrylamide,Bis）聚合而成。第41页/共82页聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的

31、浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。第42页/共82页二维电泳的基本原理据蛋白质的两个一级属性等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一方向按等电点高低进行等电聚焦分离（IEF），在第二方向按照分子量大小进行SDS-PAGE分离（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）1st dimension:Isoelectric focusing(charge)2nd dimension:SDS-PAGE(size)第43页/共82页二维电泳结果二维电泳分离后的蛋白质

32、经染色（考马氏亮蓝染、银染、负染、荧光染色、放射标记染色）、通过图象标志扫描存档，最后显现的是二维排列的“满天星”，每个星点代表一个蛋白质。最终获得蛋白质相对分子量、等电点和相对丰度三方面的数据。传统的二维电泳最好条件下20cm 20cm的胶理论上可分辨10,000个蛋白点（各个方向100点），实际上只能3000个点.二维电泳得到的实验结果并非功能蛋白，事实上由于样品处理过程中涉及亚基间的二硫键还原和烷基化处理，即蛋白质的高级结构已被消除，最终得到的是蛋白质的亚基。第44页/共82页一维等电聚焦（IEF）蛋白质等电点pI是由其内氨基酸组成决定的特性物化常数。当介质pH高于其等电位置时，蛋白质带

33、负电，反之带正电；此时外加一个电场，蛋白质分子就分别向正极或负极移动，当达到其等电点位置时，蛋白质不带电就不再漂移。这样，蛋白质组内的蛋白质按照pI不同分布在胶上不同位置，这就是等电聚焦基本原理。第45页/共82页第46页/共82页等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。+7.06.05.0稳定pH梯度7.06.05.0稳定pH梯度通电+第47页/共82页等电聚焦电泳主要分为二种载体两性电解质SCA（一种人工合成的两性分子，Synthetic carrier ampholyte）：等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶(Tube gel)中进行，载体两性电解质(Carrier Am

34、pholytes)在外加电场作用下形成pH梯度。（分辨率：0.01 pH单位）pH梯度在碱性区不稳定(阴极漂移)、重复性不易掌握、上样量低和一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于开展工作。优化各种电泳条件，可达到非常高的分辨率，目前唯一分辨到10000个蛋白质，也可获得好的重复性 固相pH梯度：pH梯度的形成依赖于不同pK值的Immobilines。Immobilines是丙烯酰胺的衍生物，为非两性的弱酸和弱碱，在凝胶聚合过程中，能与聚丙烯酰胺共价结合。因此，IPG胶的pH梯度是稳定的(Immobilized pH gradients，IPG)，不依赖

35、于外加电场，基本上克服了载体两性电解质pH梯度的主要缺点。（分辨率：0.001 pH单位）第48页/共82页载体两性电解质的特性足够高的缓冲能力，pH梯度不致被蛋白改变在等电点有足够高的电导，有一定的电流通过分子量小化学性质稳定，惰性第49页/共82页载体两性电解质pH梯度的形成人工pH梯度法：利用两种不同pH的缓冲液相互扩散，在混合区形成pH梯度天然pH梯度法：多种载体两性电解质在电场作用下自然形成pH梯度。常用。没有电场作用下，溶液pH是溶液pH范围的平均值通电后，载体两性电解质向两极移动pI最小（带最多负电），向正极移动最快，在pHpI处停下来，并最接近阳极pI最大（带最多正电），向负极

36、移动最快，在pHpI处停下来，并最接近阴极第50页/共82页载体两性电解质分离蛋白质原理通电后，载体两性电解质可在支持介质中形成线性pH梯度加入蛋白质样品，蛋白质即按照等电聚焦的原理进行分离，蛋白质都位于与其等电点pI相当的pH位置上。第51页/共82页载体两性电解质的缺点早期的凝胶介质用的是载体两性电解质SCA（一种人工合成的两性分子，Synthetic carrier ampholyte），在电场中它们形成连续的pH梯度，且其有很高的缓冲能力。但存在许多缺点：A、SCA的合成方法太复杂，导致产品稳定性较差，实验重复性不好。B、SCA分子量较小，在IEF过程中由水合正离子引起的电渗流将使SC

37、A向负极漂移，造成pH不稳定。C、负极漂移造成的碱性区蛋白质难以成功聚焦，导致碱性蛋白质丢失。第52页/共82页固相pH梯度等电聚焦电泳IPG（固相pH梯度，Immobilized pH gradient）等电聚焦电泳（IEF）是在Immobilines试剂的基础上开发的技术。利用一系列弱酸弱碱丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定点附近形成pH梯度，然后共价结合在介质（丙烯酰胺）上，成为凝胶一部分，从而形成固定pH梯度。优点：分辨率高（0.001 pH单位），重复性好，pH梯度稳定，上样量更高。第53页/共82页一维固相pH梯度等电凝胶IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-

38、NH-R结构的多种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团。每种衍生物的pI值不同，不同比例的混合物构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。第54页/共82页IPG胶条的重泡涨商品化的胶条是以干胶条的形式和塑料支撑薄膜粘在一起，加样前需要先撕去薄膜在重泡涨液中泡涨。泡涨的实质：让样品能完全以可溶的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF电泳。重泡涨液的成分为8 mol

39、/L Urea,2%CHAPS,18mmol/L DTT,0.5%IPG Buffer,Bromophenol Blue Trace，和裂解液基本相同 窄pH范围的胶条，如pH9-12或pH10-12，重泡涨液的成分要根据样品做适当修改核糖体蛋白，重泡涨液的成分为8 mol/L Urea,10%v/v 2-propanol,10%v/v Glycerol,1%w/v CHAPS,20 mmol/L DTT,0.5%Pharmalyte 3-10,0.2%w/v Methycellulose第55页/共82页重泡涨中参数的选择加样方法的选择（重泡涨上样、杯上样）重泡涨可以在等电聚焦盘内进行，此时

40、样品加到重泡涨液中，在重泡涨过程中进入胶条在加样杯上样(cup-loading)方式中，胶条在专门的重泡涨盘内泡涨完成后再转入等电聚焦盘内加样。DTT的使用：10 mmol/L到100 mmol/L浓度范围内适当提高DTT的浓度可提高蛋白质的检测灵敏度 重泡涨时间至少要10小时，泡涨不充分会影响相对分子质量较高的蛋白质的吸收 重泡涨液的体积和胶条的长度相匹配，一般参照产品说明书温度的选择：温度都稳定在20，温度太低尿素会结晶出来，温度不稳定也会造成胶上蛋白质点位置的变化 电压的选择：重泡涨时加上30V或50V的低压会促进胶条对蛋白质的吸收第56页/共82页蛋白质加样方式胶内重泡涨(In-gel

41、 Rehydration)：样品在重泡涨时加入。样品加到重泡涨液中，在重泡涨过程中进入胶条推荐的方式，可以增加蛋白质上样量，也避免了在阴极或阳极加样的方向问题 加样杯加样(Cup-Loading)：重泡涨完成后再转入等电聚焦盘内用专用的加样杯加样重泡后加样相对不十分可靠，操作比较困难而且蛋白质容易在胶和样品的界面产生沉淀 某些特殊情况下，如使用pH6-11或pH6-9的胶条分离碱性蛋白质时，在阳极用加样杯加样，可以得到更好的分离图谱 纸桥加样(Paper Bridge Loading)：胶条重泡涨好以后，用1.55.0 cm的滤纸做为纸桥覆盖在胶条的一端，将样品加到滤纸上 可显著提高蛋白质的上

42、样量，并在分辨率和相对分子质量较高的蛋白质的分离方面有所改善第57页/共82页水化上样胶条面朝下覆盖在样品缓冲液上，电极位于胶面两端可以主动水化、被动水化，选择灵活水化、上样同时进行操作简便，重复性好，适于分析型实验对极酸/极碱性蛋白聚焦效果不够好第58页/共82页杯上样水化完成后使用加样杯在胶条上方上样电极间距可调，一个聚焦盘可放入不同长度的胶条对酸/碱性蛋白分离效果较好上样量较大，适于制备型实验结果重复性不如水化上样第59页/共82页等电聚焦设备GE公司公司IPGphor 水平电泳系水平电泳系统统Bio-Rad公司的公司的Protean IEF System水平电泳系统水平电泳系统 第60

43、页/共82页第61页/共82页影响蛋白载样量的因素影响IPG胶条蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量应满足后续的质谱分析电泳的目的：如果仅仅是为了得到一张好图，则无需考虑太多其它因素。待研究蛋白的丰度样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能了解包含的蛋白，需要反复实验才能完成。如果待测样品富集以后则更易分析IPG胶条的pH范围：pH范围越窄，上样量越大第62页/共82页IPG胶条的上样量IPG Strip lengthAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g/125 l200500u

44、g/125 l11cm50200 g/185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 l第63页/共82页IPG IEF 中pH梯度的选择常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。第64页/共82页预分步预分步收集收集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第第三三

45、步步用窄用窄pH范围阵列分离范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质置的功能蛋白质亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图3倍3倍第65页/共82页聚焦时间的优化理论上讲，获得最好的图谱质量和重复性所需的最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。第6

46、6页/共82页等电聚焦过程等电聚焦的电压上升分为三个阶段：首先加上一个比较低的电压，去除胶条中的过多的盐离子。然后开始加高压，电压上升的模式为缓慢上升。最后是持续高压，电压上升的模式为快速上升。第一向等电聚焦仪Protean IEF（Bio-Rad）最多可加到10000V的高压 IPGphor（GE Healthcare）的最高电压为8000V 一般原则是，根据胶条的pH范围和上样量的多少，总电压时间积可以在一定范围内调整。上样量大、pH范围窄则总电压时间积高 Bio-Rad公司胶条总的电压时间积为7cm 835 kVH,11cm 1560 kVH,17cm 25100 kVH第67页/共82

47、页等电聚焦条件Step 1Step 2Step 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7cmStep 1Step 2Step 3totaltotalStep 1Step 2Step 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRap

48、id第68页/共82页Protean IEF的聚焦设置和结果pH 4 7第69页/共82页两维间的平衡一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE时电泳能顺利进行。第70页/共82页平衡条件的选择平衡液：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺（IAA）取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。尿素和甘油可增加溶液粘度，减少电内渗。电内渗作用是由固相化的两性电解质造

49、成的，它影响蛋白质从第一向到第二向的转移SDS用于变性蛋白质，使蛋白质带上负电荷，这对第二向SDS-PAGE来讲是十分重要的 DTT和IAA分别用于打开和烷基化封闭蛋白质的二硫键 溴酚蓝用来检测电泳过程 两次平衡的时间均为15分钟，如果图谱的竖直条纹较多平衡时间可适当延长到20分钟，时间太短蛋白质没有被SDS充分包裹，容易产生水平条纹。第71页/共82页第一向到第二向的转移3T%的IPG胶条可以看作为压缩胶，所以一般只使用分离胶，但也有人用压缩胶。IPG胶条平衡好后，一般将胶条在电泳缓冲液里浸润一下可以清洗胶条，去除胶条上的平衡液润湿的胶条容易沿着玻璃板推到SDS-PAGE凝胶上 IPG胶条转

50、移到SDS-PAGE胶有两种方式先将IPG胶条放到SDS-PAGE胶上，再加入熔化的琼脂糖溶液。图谱不易变形，但在两块胶之间容易有小气泡产生。相比之下，气泡对图谱的影响较小，故为推荐方式 先加入熔化的琼脂糖溶液，再将IPG胶条放到SDS-PAGE胶上。非常好地解决了胶之间的气泡问题，但琼脂糖容易凝固，插入IPG胶条时有时会造成图谱变形。第72页/共82页聚丙烯酰胺凝胶（poly-acrylamide gel,PAG）聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAG）由单体丙烯酰胺（acrylamide，Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N，N-methylenebisacry