1.2基因工程的基本操作程序.pptx

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1、第1页/共43页步骤一：步骤一：目的基因的获取目的基因的获取 目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人们所们所们所们所需要转移需要转移需要转移需要转移或或或或改造改造改造改造的基因。的基因。的基因。的基因。如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因抗虫基因抗虫基因，植物的，植物的，植物的，植物的抗逆性抗逆性抗逆性抗逆性相关的基因，相关的基因，相关的基因，相关的基因，以及人的以及人的以及人的以及人的胰岛素基因、干扰素基因胰岛

2、素基因、干扰素基因胰岛素基因、干扰素基因胰岛素基因、干扰素基因等。等。等。等。从已有的物种中分离从已有的物种中分离从已有的物种中分离从已有的物种中分离人工方法合成人工方法合成人工方法合成人工方法合成从基因文库获得基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库利用PCR技术扩增DNADNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成（基因小、核苷酸已知）（基因小、核苷酸已知）（基因小、核苷酸已知）（基因小、核苷酸已知）第2页/共43页1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因基因文库基因文库:将含有某种生物不同基因

3、的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导入片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库的不同的基因，称为基因文库(gene library)(gene library)。基因组文库基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。文库叫做基因组文库。部分基因文库部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。因文库叫做部分基因文库。第3页/共43页第4

4、页/共43页某生物体内某生物体内全部全部DNA DNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶与运载体连接 导入基因组文库某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNAcDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接 导入部分基因文库（cDNA文库）第5页/共43页真核生物真核生物cDNA文库与的区别基因组文库文库与的区别基因组文库文库类型文库类型cDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少种间的基因交流种间的基因交流小小大大无无有有无无有有某种生物某种生物部分部分基因基因某种生物某种生物

5、全部全部基因基因可以可以部分基因可以部分基因可以第7页/共43页2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 聚合酶链式反应，在生物体外复制特定聚合酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基片段的核酸合成技术。可以获得大量的目的基因。因。第8页/共43页循环循环（重复）变性变性退火退火延伸延伸使目的基因短时间内成百万倍地扩增使目的基因短时间内成百万倍地扩增第9页/共43页PCR技术的原理：技术的原理：DNA复制复制(体外体外)过程：变性过程：变性 退火退火 延伸延伸（解链为单链）（解链为单链）（冷却）（冷却）（子链合成）（子链合成）条件：条件：引

6、物（引物（2 2种）；种）；模板模板:DNA:DNA的两条链的两条链；四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；热稳定热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）。酶）。多次重复多次重复第10页/共43页PCRPCR技术与技术与DNADNA体内复制的区别：体内复制的区别：DNADNA复制复制(体内）体内）PCRPCR技术技术引物引物解旋解旋酶酶操作环境操作环境需要需要需要需要常温条件、解旋酶、常温条件、解旋酶、ATP高温条件（高温条件（9095）DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶、聚合酶、耐高温的耐高温的Taq酶酶体内（细胞内）体内（细胞内）体外体外第11页/共43页练习有关PCRPCR技术的说法

7、，不正确的是(）A APCRPCR是一项在生物体外复制特定的DNADNA片段的核酸合成技术B BPCRPCR技术的原理是DNADNA双链复制C C利用PCRPCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列D DPCRPCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNADNA第12页/共43页（1 1）催化过程的酶是_ 。（2 2）过程也称为DNADNA的变性，此过程在温度高达90959095时才能完成，说明DNADNA分子具有_性。（3 3）由图中信息分析可知，催化过程的酶都是_，两者在作用特性上的区别是_ 。（4 4）如果RNARNA单链中有碱基100100个，其中A A占25%25%，

8、U U占15%15%，则通过该过程合成的一个双链DNADNA片段中有胞嘧啶_个。7075RNA单链杂交双链RNA链 DNA链核酸酶H单链DNA双链DNA90955560反转录酶（或逆转录酶）练习：19701970年，特明和巴尔的摩证实了RNARNA病毒能依赖RNARNA合成DNADNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNAcDNA的过程和PCRPCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：稳定DNA聚合酶催化过程的酶耐高温60第13页/共43页蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测

9、目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成3.3.通过通过DNA合成仪化学方法直接人工合成（基因比较小、核苷酸序列又已知）第14页/共43页步骤二：步骤二：基因表达载体的构建基因表达载体的构建（核心内容）（核心内容）获取目的基因获取目的基因获取目的基因获取目的基因同一种限制酶切割同一种限制酶切割DNADNA连接酶连接酶产生相同的产生相同的末末末末端端重组重组DNA DNA 1.1.表达载体的构建过程表达载体的构建过程C T T A A GC T T A A GG A A T T CG A A T T CC T T A A GC T T A A GG A A T T CG A A T T

10、CC T T A A GC T T A A GGG GGG A A T T CG A A T T C质粒质粒质粒质粒目的基因与运载体目的基因与运载体目的基因与运载体目的基因与运载体结合的过程实际上结合的过程实际上结合的过程实际上结合的过程实际上是不同来源的是不同来源的是不同来源的是不同来源的基因基因基因基因重组的过程重组的过程重组的过程重组的过程。第16页/共43页步骤二：步骤二：基因表达载体的构建基因表达载体的构建（核心内容）（核心内容）2.2.表达载体的组成表达载体的组成启动子：启动子：+目的基因：目的基因：+终止子：终止子：标记基因：标记基因：+是是 的结的结合位点，合位点，驱动驱动 过

11、程。过程。RNA聚合酶聚合酶转录转录终止终止 过程。过程。转录转录 有目的基因的有目的基因的受体细胞。受体细胞。鉴定和筛选鉴定和筛选编码人类所需的蛋白质编码人类所需的蛋白质,使生物使生物表达相应性状表达相应性状.复制原点：复制原点：启动复制启动复制第17页/共43页质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端基因表达载体的组成复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因第18页/共43页1.1.上述表达载体的启动子、目的基因

12、、终止子、标记上述表达载体的启动子、目的基因、终止子、标记基因的化学成分相同吗？基因的化学成分相同吗？都是都是DNA2.2.终止子和终止密码的化学成分是否一致？终止子和终止密码的化学成分是否一致？终止子终止子DNA,终止转录终止转录;终止密码终止密码RNA上，终止翻译上，终止翻译.第19页/共43页3.3.图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRIEcoRI、BamHIBamHI的酶切位点，ampampR R为青霉素抗性基因，tcttctR R 为四环素抗性基因，P P启动子，T T为终止子，oriori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRIEcoRI、Bam

13、HIBamHI在内的多种酶的酶切位点。据图回答：（1 1）将含有目的基因的DNADNA与质粒该表达载体分别用EcoRIEcoRI酶切，酶切产物用连接酶进行连接后，其中由 两个DNADNA片段之间连接形成的产物有 、三种 。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行 .（2 2）用上述3 3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是 ；目的基因运载体连接物运载体运载体连接物目的基因目的基因连接物分离纯化目的基因运载体连接物运载体运载体连接物第20页/共43页练习.图为某种质粒表达载体简图，

14、小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRIEcoRI、BamHIBamHI的酶切位点，ampampR R为青霉素抗性基因，tcttctR R 为四环素抗性基因，P P启动子，T T为终止子，oriori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRIEcoRI、BamHIBamHI在内的多种酶的酶切位点。（3 3）目的基因表达时，RNARNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是 。（4 4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是 。EcoRI和BamHI启动子mRNA第21页/共43页常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆

15、菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞转化：转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内体细胞内维持稳定和表达的过程维持稳定和表达的过程。转化第22页/共43页1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞 （1 1）农杆菌转化法：）农杆菌转化法：感染双子叶植物和裸感染双子叶植物和裸子植物，对大多单子叶植物没有感染力；子植物，

16、对大多单子叶植物没有感染力；（2 2）基因枪法）基因枪法：常用于单子叶植物；：常用于单子叶植物；（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法：转基因抗虫棉。：转基因抗虫棉。第23页/共43页（2 2）基因枪法）基因枪法：常用于单子叶植物；：常用于单子叶植物；第24页/共43页花的结构示意图123456789花柄花托子房花萼花瓣花柱柱头花药花丝雄蕊雌蕊（花冠）（3 3）花粉管通道法）花粉管通道法：转基因抗虫棉。：转基因抗虫棉。第25页/共43页第26页/共43页2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。3.3.将目的基因导入微生

17、物细胞将目的基因导入微生物细胞 导入大肠杆菌的方法:首先用Ca2+处理细胞，以以增大细菌细胞壁的通透性增大细菌细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态感受态细胞。第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植第27页/共43页1、检测与鉴定的目的 目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性。步骤四：目的基因的检测与鉴定步骤四：目的基因的检测与鉴定2、分子水平的检测分子水平的检测 检测是否插入了目的基因检测是否插入了目的基因

18、检测是否转录出了检测是否转录出了mRNAmRNA 检测是否翻译成蛋白质检测是否翻译成蛋白质3 3、个体生物学水平的检测、个体生物学水平的检测 做抗虫或抗病的接种实验做抗虫或抗病的接种实验抗原-抗体杂交DNA分子杂交技术DNA-RNA分子杂交技术第31页/共43页 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后，就说明目的基分子后，就说明目的基因完成了表达吗？因完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。第34页/共43页基基因因工工程程的的

19、基基本本操操作作程程序序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成复制原点 +目的基因 +启动子 +终止子 +标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定第35页/共43页1.1.以下说法正确的是以下说法正确的是以下说法正确的是以下说

20、法正确的是 （）A.A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B.B.质粒是基因工程中唯一的运载体 C.C.运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D.D.基因控制的性状都能在后代表现出来2.2.有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是 （）连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B.B.限制性核酸内切酶用于目的基因的获得限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C.C.目的基因须由运载体导入受体细胞目的基因须由运载体导入受体细胞 D.D.人工合成目的基因不用限制性核酸内切酶人工合成目的基因不用限制性核酸内切酶C C练习练

21、习A A3.在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得 A.人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因C C第36页/共43页D D4.4.不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是不属于质粒被选为基因运载体的理由是 （）A.A.能复制能复制能复制能复制 B.B.有多个限制酶切点有多个限制酶切点有多个限制酶切点有多个限制酶切点 C.C.具有标记基因具有标记基因具有标记基因具有标记基因 D.D.它是环状它是环状它是环状它是环状DNADNA5.5.有关基因工程的叙述正确的是有关基因工程

22、的叙述正确的是 （）A.A.限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B.B.重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成 C.C.质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D.D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料6.6.基因工程是在基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）A.A.人工合成目的基因人工合成目的基因 B.B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合 C.C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达D DC C第37页/共43页第38页/共43页感谢您的观看！第43页/共43页