表面等离子体共振仪器讲解.pptx

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1、表面等离子体共振仪就是应用表面等离子体共振仪就是应用 SPR SPR 原理检测生物传感芯片原理检测生物传感芯片（biosensor chipbiosensor chip）上配位体与分析物之间的相互作用情况）上配位体与分析物之间的相互作用情况.第1页/共22页下面以瑞典的Biacore3000 型 SPR 仪（右图所示）为例，简要介绍这种仪器的构成及工作原理。第2页/共22页仪器的主要构造uBiacore3000由工作单元和一台安装有 Biacore Control 软件的电脑组成。u工作单元的核心部件包括光学系统、传感器芯片、液体处理系统三个主要部分。u其他的组成部分包括LED状态指示器及温度

2、控制系统等。u其中，传感器芯片是最为核心的组件：传感器芯片提供了产生SPR信号的必需物理条件，并且分子相互作用的研究是在传感器芯片表面进行的。第3页/共22页一、光学系统一、光学系统u 其所利用的生物大分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Anaylysis）技术是基于表面等离子共振(SPR)的物理光学现象的新型生物传感分析技术.u由于其不必使用荧光标记和同位素标记，从而保持了生物分子的天然活性。u SPR共振角会随金属薄膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，折射率的变化（RU）又与结合在金属表面的生物大分子质量成正比。（具体 1000RU 的变化表示传感片表1n

3、g/mm的质量变化）u 因此，BlA 技术可以通过对反应全过程中各种分子反射光的吸收获得初始数据，并经相关处理获得结果。第4页/共22页u用 SPR 检测器所得的信息可直接来自表面的样品，也可间接来自能与样品特异结合的相关试剂，还可以从粗样品的嘈杂信号中获得微量待测样品的特异性信号。其最低检测下线为 pg 级(10-12g)。第5页/共22页二、传感器芯片（sensor chip）u在 BIA 技术中必须首先有一个生物分子偶联在传感片上，然后用它去捕获可与之进行特异反应的生物分子。u将 50nm 至 100nm 厚的金膜固定在一块玻璃片上，将此玻璃片嵌在一个塑料平板夹里，用一种折射率与棱镜匹配

4、的聚合物将芯片耦合到玻璃棱镜上，在芯片表面固定一层较容易与其它生物大分子偶联的葡聚糖分子层（使用者也可以根据需要选择非葡聚糖分子层的芯片）而成。（该偶联过程可由仪器全自动控制。）最为核心的部件第6页/共22页传感器芯片光波导耦合器件金属膜分子敏感膜第7页/共22页1 1、光波导耦合器件、光波导耦合器件u产生SPR现象必须将光波（消逝波部分）与表面等离子体波耦合并使其发生共振，因此需要使用耦合器件。耦合器件棱镜型光栅型光纤型光波导型第8页/共22页1.1、棱镜型u用于产生衰减全反射的棱镜型装置有Otto结构和Kretschmann结构，二者在结构上的区别主要是棱镜底面与金属膜之间是否存在间隙。O

5、tto型结构对此间隙的取值有严格要求，在制作和使用上都有一定难度，因此应用的比较少；Kretschmann型结构简单，制作容易实现且使用方便，较容易达到很高的灵敏度，因此应用也最为广泛，是SPR传感装置最常用的结构。对于Kretschmann结构来说，由于渐逝波需要穿透金属层，在与被测物接触的表面激发才能产生表面等离子体波，因此对金属膜的厚度有严格的限制。第9页/共22页1.2、光栅型u在光栅的表面覆盖一层金属膜，金属膜与分析溶液接触，当入射光照射在光栅表面时，反射光将出现散射，如上图，当某一阶(m=0，1，2，)的动量与表面等离子体波的动量相等时，二者发生共振。第10页/共22页1.3、光纤

6、型u光纤型SPR传感器采用光纤作为光的传输媒介，主要有两种形式：终端反射式和在线传输式，其结构如下图所示。由于光纤的独特性质，加上这种SPR传感器的结构紧凑、小巧，很容易实现微区探测、遥测和分布式检测。目前影响光纤型SPR传感器的主要问题是制作工艺复杂，成本高。第11页/共22页1.4、光波导型u 光波导型SPR传感器的原理与棱镜型十分相似，如下图所示，不同之处在于光波传输的媒介由棱镜变为光波导，在理论上，它可达到的检测精度也与棱镜型的相仿。所谓的光波导是光波传导的材料，能把光束缚在一定区域内传播。光波导型SPR传感器有其自身的优点：光波的传输途径可以人为控制；易于实现微型化；稳定性好等。第1

7、2页/共22页2 2、金属膜、金属膜u金属元素的性质各不相同。因此，选择不同种类金属材料作为构成表面等离子体共振的基质膜，将会对 SPR 光谱产生很大影响。SPR 研究的是反射光谱，所以需要在可见光范围内考虑反射率较高的金属，其随波长变化而改变的幅度较小，稳定性要好。故 Au 膜和 Ag 膜是 SPR 中最常使用的两种金属薄膜。u从SPRSPR光谱的三个特征参数（共振波长，共振宽度，共振深度）来看，在同样的条件下，银膜的共振波长的变化明显比金膜灵敏，共振深度约大于金膜，共振峰宽明显小于金膜。uAu 膜的稳定性最好，在 SPR 中具有重要应用价值，尤其适用于银膜不能使用的体系。第13页/共22页

8、u金属薄膜的厚度是影响共振深度的重要因素(见右图)。随着膜厚度的增加，共振深度变小，最小反射系数变大；当膜厚度超过一定值时，共振峰将消失。当膜厚在某一数值时，反射光强度近似为零，共振深度达到最大。通过实验，一般选择膜厚度为 50nm 左右，最多不超过 100nm。第14页/共22页3 3、分子敏感膜、分子敏感膜u 为了满足分析各种生物体系的要求，多种传感器芯片应运而生，从各类小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸和寡聚糖直至类脂、噬菌体、病毒和细胞，每一种芯片都必须能提供给科学工作者稳定的基线，高灵敏度，广泛的再生方法，反复使用性和特别好的重现性。成膜方法：1.金属膜直接吸附法2.共价连接法（生

9、物素-亲和素、葡聚糖凝胶、水凝胶、高分子膜、多肽等）3.单分子复合膜法4.分子印膜技术第15页/共22页三、液体处理系统Biacore 3000的液体流路简图的液体流路简图 自动上样装置一体化U型射流器第16页/共22页四、温度控制系统uSPR 信号对于温度变化非常敏感，所以在整个实验过程中保持传感芯片表面的温度恒定是非常重要的。Biacore 3000 采用 Peltier 元件来控制传感芯片的表面温度。如果温度不稳定，仪器前部面板上的黄色 LED会不停的闪烁。通过预先设定，实验者可以把温度控制在4-40之间任意一点。第17页/共22页五、LED状态指示器 u在仪器前部面板上有 5个 LED

10、 状态指示器，LED的最显著特点是使用寿命长，光电转换效能高，分别能够显示仪器不同方面的状态。第18页/共22页u 另外，在光源的选择上，固定波长、改变入射角测量方式的 SPR 装置多采用 He2Ne 激光器(=63218nm)作为光源。用激光器作光源，单色性好，强度高。在部分文献中发光二极管(LED)也作为 SPR 的光源，选择的波长多为 760nm。LED 的单色性也较好，且体积小，价格低，使用寿命长。u 采用固定入射角以波长为变量测量方式的 SPR仪器和装置，白炽灯中的卤钨灯是较适合的光源，因为它在可见光区有连续发射光谱，并具有足够的强度和稳定性，强度不随波长而改变，使用寿命较长。六、光源第19页/共22页采用固定入射角改变波长工作模式的 SPR 装置示意图 检测过程电荷耦合器件第20页/共22页多谢多谢!第21页/共22页感谢您的观看。第22页/共22页