实验酶的分离纯化幻灯片.ppt

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1、实验酶的分离纯化第1页，共170页，编辑于2022年，星期六酶的概念：酶的概念：酶是生物催化剂，是活细胞合成的具酶是生物催化剂，是活细胞合成的具有高度催化效率和高度特异性的一类蛋白有高度催化效率和高度特异性的一类蛋白质。质。知识回顾知识回顾第2页，共170页，编辑于2022年，星期六酶促反应的特点酶促反应的特点 它遵守一般催化剂的共同性质：它遵守一般催化剂的共同性质：1.在化学反应前后都没有质和量的改变；在化学反应前后都没有质和量的改变；2.只能促进热力学上允许进行的反应；只能促进热力学上允许进行的反应；3.只能加速可逆反应的速率，而不能改变反应的平衡点，只能加速可逆反应的速率，而不能改变反应

2、的平衡点，即不改变反应的平衡常数。即不改变反应的平衡常数。4.酶和一般催化剂都是通过降低反应活化能而使反应速酶和一般催化剂都是通过降低反应活化能而使反应速 率加快。率加快。第3页，共170页，编辑于2022年，星期六酶不同于一般催化剂的特点：酶不同于一般催化剂的特点：（一）酶的催化效率极高（一）酶的催化效率极高 通通常常比比非非催催化化反反应应高高1081012倍倍；比比一一般般催催化化剂剂高高 1071013倍。倍。催化剂催化剂每摩尔需活化能每摩尔需活化能无无18 000J18 000J胶态钯胶态钯11 700J11 700J过氧化氢酶过氧化氢酶2 000J2 000J过氧化氢分解反应所需活

3、化能过氧化氢分解反应所需活化能第4页，共170页，编辑于2022年，星期六催化剂催化剂每摩尔需活化能每摩尔需活化能无无18 000J18 000J胶态钯胶态钯11 700J11 700J过氧化氢酶过氧化氢酶2 000J2 000J第5页，共170页，编辑于2022年，星期六（二）酶具有高度特异性（二）酶具有高度特异性（二）酶具有高度特异性（二）酶具有高度特异性 1 1绝绝绝绝对对对对特特特特异异异异性性性性：有有有有的的的的酶酶酶酶只只只只能能能能作作作作用用用用于于于于特特特特定定定定结结结结构构构构的的的的底底底底物物物物，进进进进行行行行一一一一种种种种专专专专一一一一的的的的反反反反应

4、应应应生生生生成成成成特特特特定定定定结结结结构构构构的的的的产产产产物物物物，称之为绝对特异性（称之为绝对特异性（称之为绝对特异性（称之为绝对特异性（absolute specificityabsolute specificity）。）。）。）。2 2相相相相对对对对特特特特异异异异性性性性：大大大大多多多多数数数数酶酶酶酶作作作作用用用用于于于于一一一一类类类类化化化化合合合合物物物物或或或或一一一一种种种种化化化化学学学学键键键键，这这这这种种种种不不不不太太太太严严严严格格格格的的的的选选选选择择择择性性性性称称称称为为为为相相相相对对对对特特特特异性（异性（异性（异性（relativ

5、e specificityrelative specificity）。）。）。）。第6页，共170页，编辑于2022年，星期六绝对特异性绝对特异性第7页，共170页，编辑于2022年，星期六相对特异性相对特异性 图图5-9 5-9 蔗糖酶的水解作用蔗糖酶的水解作用第8页，共170页，编辑于2022年，星期六3立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异构体进立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异构体，酶对行反应，或其催化的结果只产生一种立体异构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异性立体异构物的选择性称为立体异构特异性（stereospecific

6、ity）。）。图图5-11 5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性乳酸脱氢酶的立体异构特异性第9页，共170页，编辑于2022年，星期六主要内容主要内容 单底物酶处反应动力学单底物酶处反应动力学 酶的分离纯化酶的分离纯化第10页，共170页，编辑于2022年，星期六单底物酶促反应动力学单底物酶促反应动力学酶动力学是研究酶促反应的速度问题，即研究各种因素对酶促反应速度的影响。酶动力学理论与实验在生物化学领域，特别在酶学研究中，有十分重要的作用。例如，根据某些因素对酶促反应速度的影响，可推断该酶促反应的机制。又例如，要准确测定酶活力单位，就需要对最佳反应条件及各种因素的影响进行研究。酶促反应有单底物

7、反应和多底物反应之分。单底物酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反应。第11页，共170页，编辑于2022年，星期六各种因素对酶反应速度的影响各种因素对酶反应速度的影响2、底物浓度、底物浓度3、pH （最适（最适 pH的概念）的概念）4、温度温度 （最适温度的概念）（最适温度的概念）5、激活剂、激活剂6、抑制剂、抑制剂1、酶浓度、酶浓度当当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=kE第12页，共170页，编辑于2022年，星期六第一节第一节 动力学方程推导动力学方程推导酶反应的基本动力学关系，是指酶反应速度与酶酶反应速度与酶和底物间和底物间的

8、动力学关系。因为酶和底物是构成酶反应系统最基本的因素，它们决定酶反应的基本性质、酶反应的速度规律，而其他各种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这种动力学关系是整个酶反应动力学的基础。描写这种基本动力学关系的是米氏方程米氏方程(Michaelis-Mentenequation)。v=vmaxS/(Km+S)第13页，共170页，编辑于2022年，星期六单分子酶促反应的米氏方程及单分子酶促反应的米氏方程及Km推导推导原则原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照从酶被底物饱和的现象出发，按照 “稳态平稳态平 衡衡”假说的设想进行推导。假说的设想进行推导。米氏方程米氏方程:米氏常数米氏常数:第14页，共

9、170页，编辑于2022年，星期六米米氏氏方方程程的的推推导导令令：将将（4）代入代入（3），则，则：ES生成速度生成速度：，ES分解速度分解速度：即即：则则：(1)经整理得经整理得：由于酶促反应速度由由于酶促反应速度由ES决定，即决定，即，所以所以(2)将将（2）代入代入（1）得得：(3)当酶反应体系处于当酶反应体系处于恒态恒态时时：当当Et=ES时时，(4)所以所以第15页，共170页，编辑于2022年，星期六酶反应速度与底物浓度的关系曲线酶反应速度与底物浓度的关系曲线第16页，共170页，编辑于2022年，星期六当底物浓度较低时当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比。反应速度与底物浓度

10、成正比。SVVmax目目 录录第17页，共170页，编辑于2022年，星期六随着底物浓度的增高随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速。反应速度不再成正比例加速。SVVmax目目 录录第18页，共170页，编辑于2022年，星期六当底物浓度高达一定程度当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度。反应速度不再增加，达最大速度。SVVmax目目 录录第19页，共170页，编辑于2022年，星期六第二节第二节实验数据的处理实验数据的处理分析酶促反应速度的作图法分析酶促反应速度的作图法一、一、Lineweaver-Burk法法(双倒数作图法双倒数作图法)将实验所得的一些初速度数据将实验所得的

11、一些初速度数据v和和S取倒数，得各种取倒数，得各种1/v和和1/S，将将1/v对对1/S作图，得一直线。该直线纵截距作图，得一直线。该直线纵截距1/Vmax，斜率，斜率Km/Vmax，横截距，横截距-1/Km。应用双倒数作图法处理实验数据求。应用双倒数作图法处理实验数据求Km和和Vmax等动力学常数比较方便，也是最广泛应用的一种方法，但欲要获得较准确等动力学常数比较方便，也是最广泛应用的一种方法，但欲要获得较准确的结果，实验时必须注意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在的结果，实验时必须注意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在Km附近。附近。第20页，共170页，编辑于2022年，星期六1.下图是

12、根据S在0.332.0Km范围时的实验结果而作的双倒数图，从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。S在0.332.0Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。第21页，共170页，编辑于2022年，星期六2.如果所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1/Vmax，但由于直线斜率近乎零，-1/Km则难以测得。S在3.320Km的范围的实验结果而作出的双倒数图。第22页，共170页，编辑于2022年，星期六3.如果S比Km小得多，则所作双倒数图的直线与两轴的交点都接近原点，使-1/Km和1/Vmax，都难以测准。S在0.0330.2Km的范围的实验结果而

13、作出的双倒数图。第23页，共170页，编辑于2022年，星期六二、其它线性作图法二、其它线性作图法1.Hanes-Woolf作图法即把米氏方程重排成线性方程第24页，共170页，编辑于2022年，星期六2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法作图法将米氏方程重排为线性方程：第25页，共170页，编辑于2022年，星期六3.Eadie-Scatchard作图法作图法将米氏方程重排为线性方程第26页，共170页，编辑于2022年，星期六以上三种作图法也应注意选择底物浓度，不要使S比Km高得多或低得多。上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图法应用最广泛。但此法有两个缺点：第

14、一，在vS图上，由相等增值而给出的等距离各点，在双倒数图上变成非等距离的点，且多数点集中在1/v轴附近，而远离1/v轴的地方只有少数几个点，恰好这些点又正是主观目测以确定直线最权重的那些点。第二，在测定v时产生的小误差，当取倒数时会放大。在低底物浓度下更为敏感，因在高1/S值所得的一两个不准确的点，会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择适当的S，使1/S为等距离增值而得到克服。对第二个缺点关键要注意在低底物浓度下使所测初速度误差尽可能减小。第27页，共170页，编辑于2022年，星期六S/v对S作图，S未取倒数。另两个线性作图法，v未取倒数。前者对等距离S增值所测数据作图较双倒数法更优

15、越。后者在低底物浓度下测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。三、三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法作图法这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该法是把S值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在纵轴上，然后把相应的v和S连成直线，这样所得的一簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。第28页，共170页，编辑于2022年，星期六Lee和和Wilson改良双倒数方程对数据的处理改良双倒数方程对数据的处理改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似，为其中是t这一段时间内的平均速度；为反应过程中底物浓度的算术平均值。由于积分方程对任何反应程度的数据处理都是准确的处理实验数据

16、的准确性如何，用可以通过与对比：第29页，共170页，编辑于2022年，星期六从以上计算可以看出，用改良的双倒数方程作图法处理实验数据时，即使反应已进行到30，所引入的误差也不过1左右。很明显，如果所有酶是饱和的，而且反应显著不可逆，而且没有产物抑制的情况，用改良双倒数法处理实验数据来测定Km和Vmax，可获得准确结果。如有必要，可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反应不可逆，并使产物抑制成为最小。第30页，共170页，编辑于2022年，星期六酶促反应速度的测定与酶的活力单位酶促反应速度的测定与酶的活力单位1、测定酶促反应的速度必需测初速度、测定酶促反应的速度必需测初速度2、酶活力、酶活力3

17、、酶活力的表示方法酶活力的表示方法4、酶活力测定方法酶活力测定方法：终点法终点法 动力学法动力学法 检测酶含量及存在，很难直接用酶的检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量量”（质量、体积、（质量、体积、浓浓度度）来来表表示示，而而常常用用酶酶催催化化某某一一特特定定反反应应的的能能力力来来表表示示酶酶量量，即即用用酶酶的的活活力表示。力表示。酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。学反应的速度来确定。第31页，共170页，编辑于2022年，星期六酶活力测定方法酶活力测定方法 终终点

18、点法法:酶酶反反应应进进行行到到一一定定时时间间后后终终止止其其反反应应，再再用用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动动力力学学法法:连连续续测测定定反反应应过过程程中中产产物物底底物物或或辅辅酶酶的的变化量，直接测定出酶反应的初速度。变化量，直接测定出酶反应的初速度。第32页，共170页，编辑于2022年，星期六 酶活力的表示方法酶活力的表示方法活力单位活力单位（active unit）习惯单位（习惯单位（U）:底物底物(或产物或产物)变化量变化量/单位时间单位时间 国际单位（国际单位（IU）:1moL变化量变化量/分钟分钟 Katal（Kat）

19、：）：1moL变化量变化量/秒秒比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数=U(或或IU)mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小转换系数转换系数（Kcat）底物（底物（moL）/秒秒每个酶分子每个酶分子量度酶纯度量度酶纯度比活力比活力（specific activity）量度转换效率量度转换效率第33页，共170页，编辑于2022年，星期六第四第四节 酶的分析和检测一、酶促反应初速度随一、酶促反应初速度随Et的变化的变化酶促反应的初速度随Et的变化而变化。通常在离体测定条件下，Et一般为10-1210-7mol/L，而St为10-610-2mol/L。可将米氏方程转变为以

20、下形式：这样，当S为常数时，则初速度v与Et成正比。但一个酶促反应速度，常因S的改变而改变。因此反应时间必须尽可能短，使S几乎处于恒态(即只有5以下的底物形成产物)，才能得到真正的初速度，v与Et之间的关系才会是线性的。第34页，共170页，编辑于2022年，星期六二、酶活力单位和比活力二、酶活力单位和比活力是指酶在一定作用条件下，单位时间内，使底物转化的量或产物生成的量。也就是说，酶量的多少是采用其催化能力来度量；换句话说，是采用酶催化反应的速度来度量，因为在适当的条件下，v vEE。为了使酶单位的文献报道能统一，并具有可比性，国际酶学会议曾制订了一个标准单位：在特定条件下，1分钟内能转化1

21、微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。所谓特定条件，温度定为25，pH、底物浓度等其它条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位IU)。酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。酶的比活力(specificactivity)是指每毫克蛋白中所含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。第35页，共170页，编辑于2022年，星期六三、酶的转换数三、酶的转换数转换数可用两种方法表示。其一是以分子活性(molecularactivity)来定义，即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转变的底物摩尔数(即每微摩尔酶的酶单位数)。其二是许多酶为寡聚体。含几个亚基，因此可用另一种方式来表示转换数，即在最适条件下，每摩尔活

22、性亚基或催化中心每分钟所转变的底物摩尔数。这两个值有时简单以min-1表示，即：酶的kp值约在50107min-1。碳酸酐酶是己知转换数最高的酶之一(36106min-1)。1/kp=1.7sec，即该酶一个催化周期为1.7微秒。第36页，共170页，编辑于2022年，星期六第五节第五节酶促反应的稳态前动力学酶促反应的稳态前动力学一、快反应技术一、快反应技术酶促反应动力学研究有两条途径：一是稳态动力学。它是监测整个反应，得到关于反应的笼统信息。二是稳态前动力学，它能更直接地研究整个反应中的基本步骤或部分反应，提供可用于分析复杂反应机制的更有效的数据，但需要特殊的仪器来测量快反应。所谓快反应，是

23、相对于普通的混合和观察方法所需要的时间而言。完成总反应量的一半，即所谓反应半时间，为秒或更短时间，则属快反应。采用手工混合启动反应，用普通的分光光度计等仪器所能测量的反应半时间为分和小时。而酶促反应常常是反应半时间短于一秒的快反应，采用普通方法是不行的。限制仪器测定能力的主要因素有：混合样品并充满反应池所需的时间，观察和记录变化所需的第37页，共170页，编辑于2022年，星期六时间。快速反应动力学技术因此应运而生，并得到不断发展。目前，甚至已能测定反应半时间与分子振动和转动所需时间相当的反应。化学反应半时间不可能短于10-11秒，故可认为已没有哪个化学反应是快得无法测定的。流动法和弛豫法，是

24、为研究溶液中快反应动力学而建立起来的方法。前者包括常流法、加速流动法、停流法和淬灭法；后者包括温度、压力、电磁场的跳变或周期性变化法等。由于这些方法采用与停流相似的液体处理系统和相同的快响应探测和数据采集系统，所以常在一台仪器上更换相应的附件实施上述多种测量，构成组合式仪器。第38页，共170页，编辑于2022年，星期六酶的分离纯化酶的分离纯化第39页，共170页，编辑于2022年，星期六 酶分离纯化的目的是使酶制剂产酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。品达到应用所需的纯度。第40页，共170页，编辑于2022年，星期六分离纯化过程包括分离纯化过程包括3 3个基本步骤：个基本步骤

25、：1 1 抽提抽提2 2 纯化纯化3 3 制剂制剂第41页，共170页，编辑于2022年，星期六Crude product concentration versus selling price(Dwyer,1984)第42页，共170页，编辑于2022年，星期六某些生化物质在原料液中的某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系浓度与价格的关系(1984年年)物质名浓度(C)价格(P，)尿激酶51053108荧光素酶81032106胰岛素41019104头孢菌素10102乙醇11023101第43页，共170页，编辑于2022年，星期六在分离纯化中必须注意：在分离纯化中必须注意：1 1 防止酶的变

26、性失活；防止酶的变性失活；2 2 在分离纯化过程中的每一步都在分离纯化过程中的每一步都 应检测酶的活性，以确定酶的应检测酶的活性，以确定酶的 纯化程度和回收率。纯化程度和回收率。第44页，共170页，编辑于2022年，星期六第一节第一节 酶活力的测定酶活力的测定几个名词几个名词1 酶活力或酶活性酶活力或酶活性2 酶活力单位酶活力单位3 mol催化活性（分子活性）和转换催化活性（分子活性）和转换 数（催化中心活力数（催化中心活力)4 酶的比活力酶的比活力第45页，共170页，编辑于2022年，星期六酶活力（又称酶活性）酶活力（又称酶活性）(enzyme activity)（IU/g或或IU/mL

27、)指酶催化一定化学反应的能力；用在一指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。化时的一项必不可少的指标。第46页，共170页，编辑于2022年，星期六酶活力单位酶活力单位(enzyme activity unit)表示酶活力大小的尺度；表示酶活力大小的尺度；一个国际单位（一个国际单位（IU）是指在特定条件下是指在特定条件下（25 0C），），每分钟内转化每分钟内转化1 mol底物或催化形底物或催化形成成1 mol产物所需的酶量

28、产物所需的酶量一个一个Kat是指每秒钟内转化是指每秒钟内转化1mol底物所需底物所需的酶量，的酶量，1 Kat=6 107 IU。第47页，共170页，编辑于2022年，星期六mol催化活性（分子活性）和催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力）转换数（催化中心活力）mol催化活性是指单位时间内，每个酶分催化活性是指单位时间内，每个酶分子所转换的底物分子数目；转换数（子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat)是指是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么果酶分子中只有一个活性中心，那么mol催化活性催化活性与转

29、换数相等，如果酶分子中含有与转换数相等，如果酶分子中含有n个活性中心，个活性中心，那么转换数则为那么转换数则为mol催化活性除以催化活性除以n。第48页，共170页，编辑于2022年，星期六酶的比活力酶的比活力（specific activity)酶的比活力酶的比活力是酶纯度的量度，是指是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位单位重量酶蛋白所具有的酶活力，单位为为IU/mg。比活力越大，酶纯度越高。比活力越大，酶纯度越高。第49页，共170页，编辑于2022年，星期六=酶活力的测定方法：酶活力的测定方法：终止反应法终止反应法和连续反应法。和连续反应法。第50页，共170页，编辑于

30、2022年，星期六终止反应法终止反应法在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或一定体积的反应液，用强酸强碱或SDSSDS以及加以及加热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。定方法。第51页，共170页，编辑于2022年，星期六连续反应法连续反应法无须

31、终止反应，而是在酶反应过程无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。然后计算出酶活力。第52页，共170页，编辑于2022年，星期六酶不可逆失活的原因和机理第53页，共170页，编辑于2022年，星期六蛋白质（酶）的失活机理第54页，共170页，编辑于2022年，星期六蛋白质不可逆失活的原因蛋白酶水解蛋白酶水解或自溶作用或自溶作用表面活性剂表面活性剂和去垢剂和去垢剂聚合作用聚合作用氧化作用氧化作用机械力机械力变性剂变性剂重金属离子重金属离子和巯基试剂

32、和巯基试剂冷冻和脱水冷冻和脱水热热极端极端pH蛋白质蛋白质不可逆失活不可逆失活脲和胍脲和胍高浓度盐高浓度盐螯合螯合有机溶剂有机溶剂辐射作用辐射作用第55页，共170页，编辑于2022年，星期六 蛋白质的稳定化蛋白质的稳定化第56页，共170页，编辑于2022年，星期六蛋白质稳定化蛋白质稳定化蛋白质稳定化途径蛋白质稳定化途径如何防止蛋白质的可逆伸展如何防止蛋白质不可逆失活反应发生第57页，共170页，编辑于2022年，星期六稳定蛋白质（酶）的方法稳定蛋白质（酶）的方法第58页，共170页，编辑于2022年，星期六酶分离的一般流程酶分离的一般流程 原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线

33、二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第59页，共170页，编辑于2022年，星期六第二节第二节 酶溶液的制备酶溶液的制备第60页，共170页，编辑于2022年，星期六酶溶液的制备：酶溶液的制备：把酶从生物原料中抽提出来，作成把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液酶溶液 酶溶液的制备包括：材料预处理及酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩等几个步骤。浓缩等几个步骤。第61页，共170页，编辑于

34、2022年，星期六一、材料预处理及细胞破碎一、材料预处理及细胞破碎材料预处理：材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。晶酶）。第62页，共170页，编辑于2022年，星期六微生物胞外酶微生物胞外酶可以用盐析或有机溶剂沉淀可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶胞内酶要先收集菌体，经细胞破碎要先收集菌体，经细胞破碎后提取后提取第63页，共170页，编辑于2022年，星期六动物材料动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组应先剔除结缔组织和脂肪组织等织等植物材料植物材料应去皮等以免单

35、宁等物质着色应去皮等以免单宁等物质着色污染污染第64页，共170页，编辑于2022年，星期六细胞破碎：细胞破碎：物理和化学两大类方法物理和化学两大类方法第65页，共170页，编辑于2022年，星期六1 1、物理破碎：、物理破碎：研磨（手磨，球磨和石磨），研磨（手磨，球磨和石磨），机械捣碎（匀浆器和高速组织捣机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），碎器等），高压法，高压法，爆破性减压法，爆破性减压法，专用波振荡，专用波振荡，快速冷冻融化法等。快速冷冻融化法等。第66页，共170页，编辑于2022年，星期六2 2、化学破碎：、化学破碎：渗透作用渗透作用 自溶：自溶：酶处理酶处理 表面活性剂表面活性剂

36、第67页，共170页，编辑于2022年，星期六（I I）渗透作用渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和并悬浮于含蔗糖和EDTAEDTA的稀的稀TrisTris缓冲液缓冲液中，离心，加入中，离心，加入 MgClMgCl2 2剧烈搅拌，可使一剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。些水解酶从细胞内释放出来。第68页，共170页，编辑于2022年，星期六（IIII）自溶自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，甲向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可以使细性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；胞自溶

37、；第69页，共170页，编辑于2022年，星期六（IIIIII）酶处理酶处理 用溶菌酶专一性地分解原核微生用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放物细胞壁，使胞内酶释放第70页，共170页，编辑于2022年，星期六（IVIV）表面活性剂表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。与脂蛋白形成微泡，使之溶解。第71页，共170页，编辑于2022年，星期六二、抽 提大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；用稀盐、稀碱或稀酸的水

38、溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。于切断酶与其它物质的连结。第72页，共170页，编辑于2022年，星期六1 1、提取的主要方法：、提取的主要方法：（1 1）盐溶液提取）盐溶液提取（2 2）酸溶液提取）酸溶液提取（3 3）碱溶液提取）碱溶液提取（4 4）有机溶剂提取）有机溶剂提取第73页，共170页，编辑于2022年，星期六2 2、酶提取过程的注意事项、酶提取过程的注意事项 pHpH的选择的选择 盐的选择盐的选择 温度的选择温度的选择 抽提液用量抽提液用量 其它

39、其它第74页，共170页，编辑于2022年，星期六pH的选择的选择首先考虑酶的稳定性；其次应首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择远离等电点；一般选择pH4-6pH4-6 为宜。为宜。第75页，共170页，编辑于2022年，星期六盐的选择盐的选择 大多数酶在低浓度的盐溶液大多数酶在低浓度的盐溶液 中有较大的溶解度，一般选中有较大的溶解度，一般选 择等渗盐溶液，如择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的的NaCl等。等。第76页，共170页，编辑于2022年，星期六温度的选择温度的选择 一般控制在一般控制在0-4 0C，如果酶如果

40、酶 比较稳定可以例外。比较稳定可以例外。第77页，共170页，编辑于2022年，星期六抽提液用量抽提液用量常采用材料量的常采用材料量的1-5倍倍第78页，共170页，编辑于2022年，星期六其它加入蛋白酶抑制剂、半胱氨酸或细胞色素C等，来稳定抽提系统。第79页，共170页，编辑于2022年，星期六三、酶溶液的絮凝、净化与脱色三、酶溶液的絮凝、净化与脱色第80页，共170页，编辑于2022年，星期六絮凝絮凝由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困水化层等给酶溶液的

41、离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂：多种类型絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等天然高分子：如壳多糖等第81页，共170页，编辑于2022年，星期六过滤或离心净化过滤或离心净化通过絮凝剂处理后的酶溶液通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。及脂类等大分子物质去除。第82页，共170页，编辑于2022年，星期六脱色脱色酶的工业生产中，常用

42、的脱酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。第83页，共170页，编辑于2022年，星期六四、酶溶液的浓缩四、酶溶液的浓缩冷冻干燥法冷冻干燥法 蒸发法：蒸发法：超过滤法：超过滤法：胶过滤法：胶过滤法：干燥第84页，共170页，编辑于2022年，星期六冷冻干燥法冷冻干燥法先将酶溶液冻成固体，然后先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水分子从固体表在真空状态下使水分子从固体表面直接升华。面直接升华。第85页，共170页，编辑于2022年，星期六蒸发法蒸发法目前工业上采用较多的是薄目前

43、工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空状态下使膜蒸发法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄的液膜，通过酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽液加热而迅速汽化，经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。分离器达到浓缩的目的。第86页，共170页，编辑于2022年，星期六超过滤法超过滤法将酶溶液通过只允许小将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜，分子物质通过的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。到浓缩的目的。第87页，共170页，编辑于2022年，星期六胶过滤法胶过滤法利用利用Sephadex G-250或或G-50吸水膨胀，而酶蛋白被排吸水膨胀，

44、而酶蛋白被排阻在胶的外面。阻在胶的外面。第88页，共170页，编辑于2022年，星期六其它方法其它方法吸水剂如用聚乙二醇吸水剂如用聚乙二醇(PEG)PEG)处理小量样品。处理小量样品。第89页，共170页，编辑于2022年，星期六干燥将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥第90页，共170页，编辑于2022年，星期六第三节第三节 酶分离纯化的基本过程酶分离纯化的基本过程第91页，共170页，编辑于2022年，星期六一、酶分离纯化方法的选择一、酶分离纯化方法的选择 目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂

45、蛋目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：法时，要考虑以下几个方面：首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；的了解；以酶活力和比活力为标准，判断所选择的以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；方法是否得当；严格控制操作条件，防止酶的变性失活。严格控制操作条件，防止酶的变性失活。第92页，共170页，编辑于2022年，星期六选择生物分离方法的依据选择生物分离方法的依据1 物理化学性质物理化学性质2 生物体系的特性生物体系的特性3 能用作分离和纯化依据

46、的蛋白质性质能用作分离和纯化依据的蛋白质性质第93页，共170页，编辑于2022年，星期六 1.物理化学性质物理化学性质 分分子子大大小小、分分子子量量、分分子子体体积积、极极性性、偶偶极极矩矩、熔熔点点、沸沸点点、汽汽化化热热、离离子子电电荷荷、溶溶解解度度参参数数、折折射射率率、表表面面张张力力、介介电电常常数数、密密度度、粘粘度度、酸酸碱碱强强度度、pK值值、等等电电点点(pI)等等等等。物物质质之之间间得得以以分分离离的的主主要要依依据据就就是是组组分间的物化性质的差异。分间的物化性质的差异。在在涉涉及及具具有有生生物物活活性性物物质质的的体体系系中中，有有关关这这方方面面的的数数据据

47、与与化化工工产产品品相相比比要要少少得得多多，严严重重影影响响了了生生物物分分离离过过程程的的有有效效进进行行。因因此此，生物体系的物化性质的研究应成为一个重点。生物体系的物化性质的研究应成为一个重点。第94页，共170页，编辑于2022年，星期六2.生物体系的特性生物体系的特性 对对一一些些有有生生物物活活性性的的物物质质，不不是是能能够够用用一一般般的的物物化化性性质质来来表表达达的的，这这就就需需要要了了解解这这些些物物质质的的生生物物特特性性，特特别别要要知知道道影影响响生生物物特特性性变变化化的的条条件件和和这这些些物物质质失失活活的的因因素素，包包括括溶溶剂剂、pH值值、温温度度等

48、等等等。这这种种保保持持生生物物质质特特性性不不至至于于改改变变的的措措施施就就是是所所谓的稳定性维持。谓的稳定性维持。第95页，共170页，编辑于2022年，星期六3.能用作分离和纯化依据的蛋白质性质能用作分离和纯化依据的蛋白质性质 能能从从混混合合物物中中分分离离和和纯纯化化出出一一种种蛋蛋白白质质是是因因为为不不同同蛋蛋白白质质有有着着不不同同的的物物理理和和化化学学性性质质。这这些些性性质质是是由由于于蛋蛋白白质质的的氨氨基基酸酸数数目目和和序序列列不不同同造造成成的的。连连接接在在多多肽肽主主链链上上的的氨氨基基酸酸残残基基可可以以是是带带正正电电荷荷的的或或带带负负电电荷荷的的、极

49、极性的或非极性的、亲水性的或疏水性的性的或非极性的、亲水性的或疏水性的。此此外外，多多肽肽可可折折叠叠成成非非常常确确定定的的二二级级结结构构(螺螺旋旋、折折叠叠和和各各种种转转角角)和和三三级级结结构构，形形成成独独特特的的大大小小、形形状状和和残残基基在在蛋蛋白白质质表表面面的的分分布布状状况况。利利用用待待分分离离蛋蛋白白质质与与混混合合物物中中其其它它蛋蛋白白质质之之间间在在性性质质上上的的差差异异，即即能能设设计出一组合理的分级分离步骤。计出一组合理的分级分离步骤。第96页，共170页，编辑于2022年，星期六酶分离纯化方法酶分离纯化方法根据分子大小建立的分离纯化方法根据分子大小建立

50、的分离纯化方法根据溶解度建立的分离纯化方法根据溶解度建立的分离纯化方法根据电荷性质建立的分离纯化方法根据电荷性质建立的分离纯化方法根据亲和作用建立的分离纯化方法根据亲和作用建立的分离纯化方法根据稳定性差异建立的分离纯化方法根据稳定性差异建立的分离纯化方法第97页，共170页，编辑于2022年，星期六一、根据分子大小建立的分离纯化方法一、根据分子大小建立的分离纯化方法透析透析超过滤超过滤离心离心凝胶过滤等。凝胶过滤等。第98页，共170页，编辑于2022年，星期六1 1、透、透 析析(Dialysis)(Dialysis)法：法：过程过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小：将酶溶