ELISA的基本原理和质量控制.pptx

《ELISA的基本原理和质量控制.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ELISA的基本原理和质量控制.pptx（36页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、ELISA的基本原理的基本原理的基本原理的基本原理抗原或抗体在体外抗原或抗体在体外结合到某种固相载体结合到某种固相载体表面后，仍然能保持表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相其免疫学活性而能相互互特异性特异性结合。结合。第1页/共36页将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从

2、而使测定方法达到很高的法达到很高的敏感性敏感性。第2页/共36页抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅颜色的深浅与与特异特异性抗体水平性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分成比例关系，可进行定性和定量分析。析。第3页/共36页间接法间接法ELISAELISA|间接法间接法ELISAELISA（Indirect ELISAIndirect ELISA）将特异性抗原包被于固相载体将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤

3、后再加入酶标的抗人IgGIgG或或IgMIgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。第4页/共36页1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色间接法ELISA第5页/共36页使用RFRF吸附剂 类风湿因子（10）是一种自身抗体，主要有IgM组成，能与抗原抗体复合物的FC段结合，非特异性IgM抗体（风湿因子）的存在将导致IgM检测出现假阳性结果。第6页/共36页麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人酶标IgM抗体类风湿因子阳性结果假阳性结果第7页/共36页RFRF吸附剂的组成RFRF吸附剂人IgGIgG抗体Protein AProtein A羊抗人IgGIgG第

4、8页/共36页 因此，在使用间接法ELISAELISA进行IgMIgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理 。第9页/共36页捕获法捕获法ELISAELISA|捕获法捕获法ELISAELISA（Capture ELISACapture ELISA）专门用来检测专门用来检测IgMIgM型抗体的方型抗体的方法。将抗人法。将抗人IgMIgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgMIgM抗体抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgMIgM抗体结合，洗涤后抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤

5、后加入底物显色。再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。第10页/共36页1.加样2.孵育3.洗涤4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.显色捕获法ELISA第11页/共36页ELISA试剂的组成试剂的组成固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯材质的微孔板，多为材质的微孔板，多为8 8 8 8 12121212道道96969696孔板条。孔板条。吸附能力吸附能力 通透性通透性 均一性均一性第12页/共3

6、6页酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。不产生非特异反应。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（HorseRadish PeroxidaseHorseRadish Peroxidase，简称，简称HRPHRP）是目前应用）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。碱性磷酸酶碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase Alkaline Phosphatase，简称，简称APAP）是从小牛肠粘膜中提）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取

7、工艺复杂，价格比较昂贵。取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。第13页/共36页底物：底物：不同种类的酶要求使用不同的底物不同种类的酶要求使用不同的底物。l lHRPHRPHRPHRP邻苯二胺邻苯二胺（OrthopenylenediamineOrthopenylenediamineOrthopenylenediamineOrthopenylenediamine，OPDOPDOPDOPD）、四甲基联苯胺四甲基联苯胺（TetramethylbenzidineTetramethylbenzidineTetramethylbenzidineTetramethylbenzidine，TMBTMBTM

8、BTMB）和）和ABTSABTSABTSABTS 2,2-2,2-2,2-2,2-连氮连氮-双双-(3-(3-(3-(3-乙基苯并乙基苯并噻唑啉磺酸噻唑啉磺酸)，OPDOPDOPDOPD为在为在ELISAELISAELISAELISA中应用最多的底物，中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。是配成应用液后稳定性差。TMBTMBTMBTMB经酶作用后由无色经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。色。l lAPAPAPAP对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯

9、（p-p-p-p-nitrophenylphosphatenitrophenylphosphatenitrophenylphosphatenitrophenylphosphate，p-NPPp-NPPp-NPPp-NPP）作为底物。产）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm405nm405nm有吸收峰。用有吸收峰。用NaOHNaOHNaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。第14页/共36页洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA

10、ELISAELISAELISA在洗在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术关键技术，应引，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是中性缓冲液，一般是吐温吐温20202020（聚山梨酯聚山梨酯 ）。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。第15页/共36页标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。RFRF吸附剂：在进行吸

11、附剂：在进行IgMIgM抗体检测时，间接抗体检测时，间接ELISAELISA方法需要使用方法需要使用RFRF吸附剂去吸附剂去除类风湿因子的干扰作用。除类风湿因子的干扰作用。第16页/共36页ELISA的质量控制的质量控制及注意事项及注意事项第17页/共36页ELISA质量控制的目的质量控制的目的获得正确的检验结果。使不同时间和地点的ELISA检验结果具有可比较性。第18页/共36页ELISA准确度准确度的影响因素的影响因素患病率患病率在检测真正感染疾病患者中，检测的准确度随着该传染病在人群中的患病率的变化而改变。患病率越高，被检测者阳性是真阳性的可能性就越大。第19页/共36页患病率和阳性预测

12、值患病率和阳性预测值(PPV)的关系的关系 患病率 高 低被检测数量 10000 10000总阳性数 1000 30假阳性数量 27 27真阳性数量 973 3阳性预测值（PPV）97.3%10%PPV=患病率灵敏度/患病率灵敏度+(1-患病率)(1-特异性)100%第20页/共36页解决方法解决方法试剂试剂 1试剂试剂 2试剂试剂 1+2敏感度敏感度特异度特异度99.0%99.0%99.5%99.9%(串联串联)患病率患病率PPVPPVPPV0.2%28.4%66.4%99.75%2.0%80.2%80.2%99.97%20.0%98.0%99.6%99.99%第21页/共36页ELISA准

13、确度准确度的影响因素的影响因素实验过程实验过程实验操作人员的教育背景和培训标本的条件试验过程中的对照试剂设备结果的解释结果的抄写和报告第22页/共36页ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制仪器仪器n移液器，ELISA的加样量小，选择量程合适的加样枪，其准确性直接影响试验结果。定期进行校准。n水浴锅，有外部温度计对仪器温度进行校准。n洗板机，残留液体不能使拍干的纸变湿，定期检查加液孔有无堵塞。n酶标仪，定期检查。第23页/共36页 ELISA的标本最为常见的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。1.要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基

14、团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。2.样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制标本标本第24页/共36页3.血清标本如是以无菌操作分离，则可以在28下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70以下。4.冻存

15、的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。5.标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。第25页/共36页p标准操作规程（SOP）p实验纪录日期操作人员试剂批号试剂有效期p试剂准备，使用前在室温平衡20min以上，以便在温育时很快达到反应要求温度，避免弱阳性标本产生假阴性结果。p水浴ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制其它其它第26页/共36页p试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内pELIS

16、A板的空白对照OD值在控制范围内p实验室内部质控血清(In-House Control,IHC)每次试验都要包括一个实验室质控血清。可以监测标本处理过程，而试剂质控只能监测之后的过程。确保每次试验操作的正确性和结果的一致性。尤其是可以监测试剂不同批号之间的差异。可以做质控图。ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制内部质控内部质控（IQC）包括）包括试剂质控和内部质控试剂质控和内部质控血清血清第27页/共36页收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清，56加热30min灭活。用0.45um滤器过滤除去污染物和杂质，用阴性血清、正常人血清或PBS缓冲液将收集的血清进行一系

17、列稀释。检测稀释标本并绘制s形标准曲线。选择Cutoff值1.5至3倍OD值所对应的稀释度，作为IHC。一次准备12个月使用量，分装到血清管，每管30ul，于-20保存备用。内部质控血清内部质控血清（IHC）的制备的制备第28页/共36页如何用内部质控血清如何用内部质控血清（IHC）做质控做质控图图 在常规试验条件下，将IHC放在常规样本中，进行20次检测，计算均值和标准差（SD）。并绘制质控图。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时：一次超过2SD2SD但小于3SD3SD作为“告警”一次超出3SD3SD、连续二次超出2SD2SD、3-53-5次连续处于一侧的2SD2SD之内

18、、5 57 7次连续偏向横轴的一侧，均为失控 同一批号试剂和质控血清。第29页/共36页举例：质控图举例：质控图第30页/共36页“即刻性”质控 只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。即刻法的建立具体计算方法如下：1)先将测定值从小到大排列2)计算X和SD。3)计算SDI上限和SDI下限值。4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。第31页/共36页 当SDI上限值和SDI下限值n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限有一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD3SD范围，处于“告警”状态；当SDI上限和SD

19、I下限有一值n3SD时，说明该值已在3SD范围之外，属“失控”。数值处于“告警”和“失控”状态应舍去，重新测定。第32页/共36页Nn3sn2snn3sn2s31.151.1512 2.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.702.4172.101.94162.752.4482.222.0317 2.792.4792.32 2.1118 2.822.50102.412.18192.85 2.53112.482.23 202.882.56SI值表第33页/共36页ELISA实验过程中涉及的质量控制实验过程中涉及的质量控制外部质控外部质控ELISA试验中的外部质控(EQA)用于连续地、客观地评价不同实验室之间的检测结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。主要控制试验结果的准确度。p发放质控血清（组合血清）进行调查（PT）。定期发放质控血清至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果上报。p由上级实验室定期对下级的检测结果进行复核。p现场调查，携带质控血清到实验室进行现场操作，并对结果进行评价。第34页/共36页第35页/共36页感谢您的欣赏！第36页/共36页