ELISA基础知识及常见问题的处理.pptx

《ELISA基础知识及常见问题的处理.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ELISA基础知识及常见问题的处理.pptx（18页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、ELISA检测方法 夹心法:双抗原（抗体）夹心法是检测抗原最常用的方法，其检测方法：双抗原夹心：固相(包被)抗原Ag+样品(抗体Ab)+酶标抗原Ag*Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)显色双抗体夹心：固相(包被)抗体Ab+样品(抗原Ag)+酶标抗体Ab*Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)显色第1页/共18页间接法间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。其检测方法：固相(包被)抗原Ag+样品(抗体Ab)+酶标二抗Ab*Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)显色第2页/共18页竞争法其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗

2、体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应：固相(包被)抗原Ag+样品(抗体Ab)+酶标抗体Ab*Ag-Ab+底物(TMB)不显色(+)固相(包被)抗原Ag+样品(无抗体Ab)+酶标抗体Ab*Ag-Ab*+底物(TMB)显色(-)第3页/共18页诊断试剂所用的质量指标及相互关系：灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示检测下限的能力。相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）100%测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控血清、阳性标本稀释终点、血清盘（pannel）及临床标本阳性率。灵敏度标准品可以从卫生部临检中心购买，质控血清可以从卫生部临检中

3、心购买，也可以自己配制。因为质控血清不一定是原倍血清，或由于片段、亚型、位点等原因，评定试剂盒的灵敏度都带有一定的片面性。阳性标本稀释终点的方法常用于不同试剂盒的比较，但也有上述的片面性。阳性pannel有些可以从卫生部临检中心购买，如HBsAg阳性pannel，也可以自己配制。临床标本阳性率，是一种粗略的估计，但对临床很实用。第4页/共18页特异性：真阴性标本的检出能力。相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）100%测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床标本阴性率。质控血清、血清盘可以从卫生部临检中心购买，也可以自己配制。自己配制时注意阴性标本的在血清盘中的比例以及代表性。临床标本阴性百分率

4、是临床使用中对试剂盒特异性的粗略的判断。如果数批产品都通过了特异性参比测定，是否产品的特异性就一样了呢？不一定。因为特异性参比品的数量不可能很大（样本与整体的差异），引起非特异性的因素很多，目前尚不完全清楚。质控血清盘也存在同样的问题。第5页/共18页有关名词简介 质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而配制的血清。质控血清可以是定值也可以是不定值，可以购置也可以自配。自己配制时要注意选用无脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成分对结果的影响。因质控血清与临床标本不一致，应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用于质控活动，不可用于标定仪

5、器或评价方法。用于室内质控的质控血清一般选取CUTOFF值2-3倍的质控品。第6页/共18页室内质控：实验室内部使用控制实验结果可靠性的一种质量控制。室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性的一种考核，可分为国家级和地方级的室间质评。可以理解为“各个实验室的质量评比”。第7页/共18页临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳性或有临床意义水平的数值，临界值的确定是测定大量数据后应用统计学方法确定的。许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方法。本底：就是底色。如ELISA HBsAg，阳性显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色的情况。ELISA 抗HBcAb，阳性不显色，阴性显色，本底就是整个阳性

6、显色的情况。第8页/共18页阴性对照及阳性对照：阴、阳性对照若有正确的结果，对试剂盒操作的结果可以有粗略的判断。空白对照：对ELISA试剂来说，空白对照实际上是不加标本不加酶做对照。空白对照主要测系统的吸光率。空白对照在单波长测量时显得尤其重要。第9页/共18页ELISA 试剂常见问题及解答ELISA试剂的原理基础为抗原抗体免疫反应，在生产、储存、运输、使用等各环节中，对其质量特性产生影响的因素众多。此外，其显色系统中的过氧化物酶在生物样品中普遍存在，故在客户使用过程中经常会产生某种非期望的结果。对问题进行客观的分析、有针对性的解决问题，不仅是用户的希望，也是促进我们自身产品质量提高的关键。以

7、下为ELISA试剂盒常见问题处理对策：第10页/共18页显色浅 灵敏度低序号原因解决方法1试剂盒运输时间过长，受高温天气影响，酶的活性降低。试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输时间。2试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏条件不正确。试剂盒内所有组分都应当在4冷藏，未使用完的板条要密封保存。3试剂盒使用时已超出有效期。过期试剂盒不可以使用。4温育时间不够。严格按照说明书操作。5恒温箱温度达不到37。注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。尽量避免频繁开关恒温箱门。经常注意水箱中合适的水位。在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量高，以保证反应温度。第11页/共18页6加样量不足；

8、移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内残留液体过多。经常校正移液器。注意吸头要与移液器吻合。移液不宜过快，排放要完全。7显色剂加量不足，或加入顺序颠倒。按照说明书要求，先加入A液、后加入B液，并保证加入量。8样品用NaN3防腐，影响了酶的活性。不可以使用NaN3防腐。9试剂、样品使用前未平衡至室温。试剂、样品从低温保藏条件中拿出来后，要先平衡至室温方可以使用。10试剂开启时间过长，污染。试剂开启后应该在尽可能短的时间内用完，在保证正确贮存的前提最长不要超过。12不同批号试剂中混用不同批号试剂不能混用第12页/共18页假阳性多，本底高甚至花板 序号原因解决方法1试剂过期过期试剂不能使用2加样时污染

9、注意更换吸头。尽可能避免污染。3加酶时污染对先加样后加酶的操作，加酶时要注意吸头不要接触标本，造成污染。当可能造成污染时，一定要更换吸头，切忌侥幸心理。4恒温箱温度过高注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在370.5。5整个操作时间过长、造成反应时间不同（第一孔与最后一孔反应时间相差很悬殊）。气温高时更明显。在尽可能短的时间内完成操作。尽量不要堆积多块板子操作（尤其手工操作时）。第13页/共18页6洗液稀释倍数过高按照要求倍数稀释洗液7洗板次数不够按试剂要求，不可任意减少洗板次数8洗板时浸泡时间不够按要求操作，并适当延长浸泡时间。9手工洗板方式不正确洗板时，垂直加入洗液，保证一定的冲击力；洗液要

10、注满板孔，并保证30-60秒的浸泡时间。10洗板机调试不正确或者有故障（可通过手工洗板判定）手工洗板，并联系仪器厂家维修。11酶被污染防止组分的污染。如使用容器，注意容器的清洁。12显色液B液被污染13显色完后没有终止反应。显色完立即终止反应。第14页/共18页重复性不好 1加样量多少不一，操作时间长短不一。重复同一样品时，加样量与加样时间相同；同时注意移液器的校准。加样后应该将酶标板放置在微量振荡器上，充分混合；标本保证一致、无污染；尽可能由同一名操作人员操作。尽可能模拟相同的反应条件。2加入标本后没有混匀。3重复实验的操作人员不同，操作习惯不同。4反应时间、温度等不相同。5标本不同（被混淆或者处理不同）6精密度测定方法不标准采用正确的方法操作第15页/共18页白板 1忘记加酶严格按照说明书操作。2忘记加显色液3酶或A、B液被污染失效防止组分被污染，注意保存。4把终止液当A液注意液体组分加样顺序。第16页/共18页 谢 谢！第17页/共18页感谢您的欣赏！第18页/共18页