h蛋白质工程简介.pptx

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1、第一节 蛋白质工程简介蛋白质工程这一名称最早是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的。目前，蛋白质工程主要集中在改造现有的蛋白质。蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。第1页/共15页 蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。第2页/共15页蛋白质工程的基本原理基因DNA氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构预期功能生物功能mRNA转录翻译折叠DNA合成分子设计第3页/共15页蛋白质工程简介一、蛋白质工程的主要步骤二、蛋白质分子设计的主要依据三、经验性规律第4页/共15页蛋白质工程的

2、主要步骤通常包括：1 1 分：从生物体中分离纯化目的蛋白；2 2 测：测定其氨基酸序列；借助核磁共振和X X射线晶体衍射等手段 尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;3 3钓：设计引物或探针，从文库中获取编码该蛋白质的基因序列4 4设：设计改造方案 设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与 去折叠等对其活性与功能的影响；设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；5 5改：对基因序列改造6 6表：通过基因工程表达7检：分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。第5页/共15页蛋白质分子设计的主要依据来自三方面关系的知识：蛋白质分子间的进化关系:通过同源蛋白质序列的微观差异可找出对空

3、间结构和生物功能的影响；另一方面蛋白质的进化研究也为蛋白质的构造规则提供了信息。蛋白质一级结构与空间结构的关系，由此可以通过一级结构预测高级结构。蛋白质结构与功能的关系，找出结构改变对功能的影响。第6页/共15页疏水性氨基酸常常出现在蛋白质的活性中心区域；螺旋和折叠区通常不会是酶的活性中心或配体、底物的结合中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面，在底物结合区和配基结合区。设计突变时要注意保留脯氨酸半胱氨酸残基 因为脯氨酸常被用来终止螺旋区，而半胱氨酸常形成起稳定作用的二硫键，同时二硫键又是许多分泌性蛋白的标志。1.注意保留脯氨酸、半胱氨酸残基蛋白质工程的经验性

4、规律：第7页/共15页2.保留保守残基进行点突变时要注意保守氨基酸残基，如果要改变酶活性，底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。蛋白质工程的经验性规律：第8页/共15页3.保留潜在的N糖基化位点应注意保留潜在的 N糖基化位点(AsnXSerThrXPro)中的Asn、Ser 或Thr。在很多情况下，特别是分泌性蛋白和穿膜蛋白，能否正确糖基化对蛋白质活性的影响很大。蛋白质工程的经验性规律：第9页/共15页4.可删除某一外显子含有内含子的序列，可删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白质其余部分的正确折叠。蛋白质工程的经验性

5、规律：第10页/共15页5.构建嵌合体同源蛋白嵌合体：应尽量使其接合部位落在具有相同或相近功能的氨基酸序列中。非同源蛋白嵌合体：接合部位应尽量位于所预测结构的边缘。蛋白质工程的经验性规律：第11页/共15页6.鉴定功能性结构域目的蛋白的三维结构一无所知，在目的基因序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域，插入六繁体接头后，在原蛋白质序列中添加了两个氨基酸，这比插入更多的氨基酸对白蛋质整体功能的破坏要轻。蛋白质工程的经验性规律：第12页/共15页7.避免直接利用天然存在的限制性 酶切位点进行基因删除进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。如果直接利用这种限制性内切酶位点，很容易破坏正确的ORF，或得到的缺失突变体边界不能落在适当的位置，而使蛋白质不能正确折叠。蛋白质工程的经验性规律：第13页/共15页思考题1、蛋白质工程的基本原理。2、蛋白质工程的主要步骤是什么？3、蛋白质分子设计的主要依据哪些？4、简述到目前为止在蛋白质改造中所积累的经验性规律。第14页/共15页感谢您的观看！第15页/共15页