酶的组织化学.pptx

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1、酶组织化学反应主要经过两步：酶组织化学反应主要经过两步：1.1.酶促反应，即酶催化细胞内相应底物，生成无色的初级反应底物。酶促反应，即酶催化细胞内相应底物，生成无色的初级反应底物。2.2.显显色色反反应应，捕捕获获和和偶偶联联。将将初初级级反反应应产产物物与与捕捕获获剂剂反反应应，经经过过一一步步或或两两步步反反应应生生成成有有色色的的最最终终反反应应产产物物，或或将将初初级级反反应应产产物物与与一一些些偶偶联联剂剂发发生生偶偶联联反应生成有色沉淀，显示酶活性部位。反应生成有色沉淀，显示酶活性部位。第1页/共22页遵循原则：遵循原则：1.1.尽量保持组织细胞生活时的形态和结构。尽量保持组织细胞

2、生活时的形态和结构。2.2.尽量保持组织细胞生活时酶及其他成分的活性，不影响酶的活性和分布。尽量保持组织细胞生活时酶及其他成分的活性，不影响酶的活性和分布。3.3.底物和辅助剂必须迅速而同步地渗透到组织和细胞中去。底物和辅助剂必须迅速而同步地渗透到组织和细胞中去。4.4.底物最好只能被一种酶催化分解。底物最好只能被一种酶催化分解。第2页/共22页 5.5.尽量减少初级反应产物在组织细胞内的弥散程度。尽量减少初级反应产物在组织细胞内的弥散程度。6.6.反应产生的最终反应产物应是不溶于水的有色而稳定的物质，沉积于原位，反应产生的最终反应产物应是不溶于水的有色而稳定的物质，沉积于原位，其颜色深度与物

3、质含量或酶活性应有一定量效关系。其颜色深度与物质含量或酶活性应有一定量效关系。第3页/共22页 7.7.由于酶的活性可受到很多因素影响，因而在酶生化方面有许多要求，以由于酶的活性可受到很多因素影响，因而在酶生化方面有许多要求，以保证充分显示酶的活性：保证充分显示酶的活性：最适孵育温度（最适孵育温度（25-3725-37。C C）最适最适pHpH值值 最适底物及辅助物浓度最适底物及辅助物浓度 激活剂与抑制剂激活剂与抑制剂 第4页/共22页酶的组织化学方法基本原理酶的组织化学方法基本原理沉淀反应法沉淀反应法 1.1.金属盐法金属盐法（金属阳离子沉淀反应）由于酶的活性可使孵育底物分解，其（金属阳离子

4、沉淀反应）由于酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基团可与金属离子结合而产生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性生成的基团可与金属离子结合而产生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性的有色金属盐沉淀。如的有色金属盐沉淀。如钙钙-钴法显示碱性磷酸酶。钴法显示碱性磷酸酶。第5页/共22页 2.2.偶联偶氮色素法偶联偶氮色素法 由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解产物可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性的偶氮色素，以证明产物可与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性的偶氮色素，以证明酶的活性部位。酶的活性部位。第6页/共22页电子传递法电子传递法

5、 根据氧化还原的原理显示氧化酶和脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢根据氧化还原的原理显示氧化酶和脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢氧化，脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐或双四唑盐结合，后者被还原氧化，脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐或双四唑盐结合，后者被还原成甲或双甲潜紫蓝色沉淀。如成甲或双甲潜紫蓝色沉淀。如琥珀酸脱氢酶显示方法属于此法。琥珀酸脱氢酶显示方法属于此法。第7页/共22页 水解酶类水解酶类 水解酶催化下列反应水解酶催化下列反应 ：AB+HAB+H2 2O AH+BOHO AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。第8页/共22页 碱性磷酸酶钙碱性

6、磷酸酶钙-钴显示法钴显示法 原理：原理：AKPAKP在有激活剂（在有激活剂（MgMg+）存在和）存在和pH9.4pH9.4时，将磷酸盐底物分解产生磷时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的钙盐所捕获，在有酶活性存在处酸根离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用生成磷酸钙沉淀，再加入硝酸钴，用CoCo2+2+置换置换 CaCa2+2+，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色需通过硫化铵处理形成黑色硫化钴颗粒沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与颗粒沉淀，显示酶活性所在部位，

7、此沉淀与AKPAKP含量成正比。含量成正比。第9页/共22页 试剂配制：试剂配制：1.1.作作用用液液 2%2%巴巴比比妥妥钠钠 5ml5ml；3%-3%-甘甘油油磷磷酸酸钠钠 5 5 mlml；2%2%无无水水氯氯化化钙钙 10ml10ml；0.1%0.1%硫酸镁硫酸镁 0.5 ml0.5 ml；蒸馏水；蒸馏水 2.5 ml2.5 ml。此液此液pHpH为为9.49.4，如不到，如不到9.49.4，可用，可用0.1N NaOH0.1N NaOH调节。调节。2.2%2.2%硝酸钴硝酸钴 3.1-2%3.1-2%硫化铵硫化铵（现配）（现配）第10页/共22页 操作步骤操作步骤 1.1.新鲜组织恒

8、冷切片，切片直接入孵育液新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育液3737。C 10-40 C 10-40 分钟。分钟。2.2.流水洗流水洗2 2分钟。分钟。3.2%3.2%硝酸钴硝酸钴5 5分钟。分钟。4.4.蒸馏水洗。蒸馏水洗。5.5.硫化铵硫化铵3030秒秒-1-1分钟。分钟。6.6.蒸馏水洗。蒸馏水洗。7.7.甘油明胶封固。甘油明胶封固。第11页/共22页碱性磷酸酶结果：结果：AKPAKP所在部位呈黑色硫化钴沉所在部位呈黑色硫化钴沉淀。淀。第12页/共22页6-磷酸葡萄糖酶结果：酶活性处为棕黄色硫化铅沉淀，细胞核为阴性反应。第13页/共22页 对照对照 去底物对照，作用液中以蒸馏水代替去底物对

9、照，作用液中以蒸馏水代替-甘油磷酸钠，其他步骤同上，甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反应阴性。酶反应阴性。第14页/共22页氧化还原酶氧化还原酶催化氧化还原反应的酶。催化氧化还原反应的酶。第15页/共22页 琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶（SDHSDH）硝硝基基四四唑唑盐盐法法 原原理理：琥琥珀珀酸酸脱脱氢氢酶酶（SDHSDH）作作用用于于底底物物琥琥珀珀酸酸钠钠，脱脱下下氢氢，以以无无色色的的硝硝基基四四唑唑盐盐为为受受氢氢体体，后后者者获获氢氢后后被被还还原原为为不不溶溶于于水水的的有有色色甲甲潜潜，原原位位沉沉积积于酶活性部位于酶活性部位。第16页/共22页试剂配制试剂配制 0.2M0.2M磷酸缓

10、冲液磷酸缓冲液pH7.6 5mlpH7.6 5ml1 1A A液液 0.2M0.2M琥珀酸钠琥珀酸钠 5ml5ml B B液液 0.1%0.1%（1mg/ml1mg/ml）硝基四唑盐（）硝基四唑盐（Nitro-BTNitro-BT）10ml10ml 临用前将两液等量混合，调整临用前将两液等量混合，调整pHpH至至7.67.6。第17页/共22页 操作步骤：操作步骤：1.1.新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育液新鲜组织恒冷切片，切片直接入孵育液3737。C 5-40C 5-40分钟。分钟。2.2.蒸馏水洗。蒸馏水洗。3.3.甘油明胶封固。甘油明胶封固。第18页/共22页 琥珀酸脱氢酶 结果：结果：

11、酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。第19页/共22页 对照对照 另配一孵育液，以等量的蒸馏水代替另配一孵育液，以等量的蒸馏水代替0.2M0.2M琥珀酸钠液，酶活性部位呈琥珀酸钠液，酶活性部位呈阴性。阴性。第20页/共22页 注意事项：注意事项：1.1.取材要迅速，立即低温冷冻，否则容易引起酶的扩散。取材要迅速，立即低温冷冻，否则容易引起酶的扩散。2.2.为节省染液，可采用滴染，使孵育液盖过切片，置于湿盒内孵育。为节省染液，可采用滴染，使孵育液盖过切片，置于湿盒内孵育。3.3.若若孵孵育育液液中中加加二二甲甲亚亚砜砜1ml1ml，可可使使线线粒粒体体的的膜膜通通透透性性增增加加，作作用用快快，酶酶定定位清晰。位清晰。第21页/共22页感谢您的观看！第22页/共22页