哺乳动物胚胎与配子生物工程技术.pptx

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1、第一节、胚胎移植第一节、胚胎移植（Embryo TransplantEmbryo Transplant）定定义义：将将良良种种母母畜畜配配种种后后的的早早期期胚胚胎胎取取出出，移移植植到到同同种种、生理状态相同的其他母畜体内，使之继续发育成为新个体。生理状态相同的其他母畜体内，使之继续发育成为新个体。一、概述提供胚胎的母畜称为供体（Donor）接受胚胎的母畜称为受体（Recipient）第1页/共99页二、胚胎移植的过程及意义二、胚胎移植的过程及意义1 1、充分发挥良种母畜的繁殖潜力。、充分发挥良种母畜的繁殖潜力。2 2、加速品种改良，扩大良种畜群。、加速品种改良，扩大良种畜群。3 3、诱产双

2、胎，提高生产效率。、诱产双胎，提高生产效率。4 4、防疫需要和克服不孕。、防疫需要和克服不孕。5 5、基础研究手段。、基础研究手段。6 6、满足畜牧业现代化的需要。、满足畜牧业现代化的需要。第2页/共99页1 1、遗传物质遗传物质来自来自亲代。亲代。2 2、营养物质营养物质来自来自受体。受体。三、胚胎移植的特点三、胚胎移植的特点第3页/共99页四、胚胎移植的生理学基础和原四、胚胎移植的生理学基础和原则则1 1、母畜发情后生殖器官的孕向发育；、母畜发情后生殖器官的孕向发育；2 2、早期胚胎呈游离状态；、早期胚胎呈游离状态；3 3、胚胎移植基本上不存在免疫问题；、胚胎移植基本上不存在免疫问题；4

3、4、胚胎与供受体的关系。、胚胎与供受体的关系。(一)生理学基础第4页/共99页(二二)胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则 1 1、胚胎移植前后所处环境的一致性。、胚胎移植前后所处环境的一致性。种属的一致性；种属的一致性；生理的一致性；生理的一致性；收集和移植部位的一致性。收集和移植部位的一致性。第5页/共99页2 2、胚胎发育的期限、胚胎发育的期限 不超过周期黄体的寿命。通常是在供体发情配种后3-8天内收集胚胎。第6页/共99页3、胚胎的质量0-2d1-3d2-3d3-5d4-5d5-6d5-7d7-8d7-9d8-10d9-11d第7页/共99页五、胚胎移植的技术过程五、胚胎移植的技术过程

4、供受体的选择；供受体的选择；供体的超排处理与配种和受体的同期发情；供体的超排处理与配种和受体的同期发情；胚胎的收集；胚胎的收集；胚胎的检查；胚胎的检查；胚胎移植。胚胎移植。第8页/共99页牛胚胎移植示意图第9页/共99页Boer胚胎移植示意图优良公Boer羊供体母Boer羊超排手术取胚受体母山羊同期发情后代第10页/共99页(一一)供体和受体的选择供体和受体的选择供体：供体：良种母畜。良种母畜。受体：受体：良好的繁殖性能，健康、良好的繁殖性能，健康、体况中上等。体况中上等。第11页/共99页(二二)供体超数排卵处理供体超数排卵处理和受体和受体母畜的同期发情母畜的同期发情 1、超排目的 得到足够

5、量的合格胚胎。2、超排方法 第12页/共99页 （发情9 11天）FSHPG法牛超数排卵早：；晚：早：；晚：早：；晚：早：；晚：发情后配种或输精两次，每隔6h输一次(为0d)第67d冲洗子宫：盐酸利多卡因尾椎麻醉桑椹胚早期囊胚第13页/共99页PMSG法牛超数排卵发情第1617d，注射PMSG15003000IU隔日注射 hCG10001500IU2448h发情，配种或输精（为第0d）第67d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚第14页/共99页FSHPG法羊超数排卵 早：FSH（国产，瓶）；晚：FSH 早：FSH；晚：FSH早：FSH+PGF22ml；晚：FSH2448h发情，配种或输精两次（为第0

6、d）发情周期第1213d（绵羊）、1618d（山羊）第6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚同时静脉注射LH100150IU*国产FSH总量为150300IU（一）第15页/共99页PMSG法羊超数排卵发情周期的 1213d（绵羊）、第1618d（山羊）注射PMSG8001500IU2448h发情，配种或输精（为第0d）同时注射hCG500750IU第6d冲洗子宫，获得桑椹胚早期囊胚（二）第16页/共99页PMSG法小鼠超数排卵注射PMSG1020IU48小时后注射hCG1020IU，公母合笼24小时后刺破输卵管，获得早期受精卵第17页/共99页 3、受体母畜的同期发情 与供体母畜超排同时进行。与供

7、体母畜超排同时进行。P P4 4、PGFPGF2a 2a 第18页/共99页(三三)供体母畜的配种供体母畜的配种 要求：1 1、优良公畜的精液；、优良公畜的精液；2 2、精子活率高、密度大且两次配种。、精子活率高、密度大且两次配种。第19页/共99页同期发情与超排程序同期发情与超排程序放栓发情鉴定配种0-910111213141516171819207:00 FSH 4ml18:00 FSH 4 ml7:00 FSH 2.5ml18:00 FSH 2.5ml7:00 FSH 2ml14:00 PG6ml18:00 FSH 2ml7:00 FSH 1.5ml14:00 取栓取栓18:00 FSH

8、 1.5ml配种配种检查黄体冲胚移胚第20页/共99页第21页/共99页(四四)胚胎的收集胚胎的收集 1 1、手术法收集胚胎手术 优点：冲卵比较彻底缺点：手术对动物剌激性大第22页/共99页从子宫角顶端冲洗输卵管：牛、羊、兔胚胎在输卵管中第23页/共99页从输卵管伞处冲洗输卵管：猪、马胚胎在输卵管中第24页/共99页胚胎在子宫角时从子宫角上端向基部冲洗第25页/共99页 2、非手术法收集胚胎优点：对动物损伤小，缺点：冲卵不彻底，需要冲卵液多第26页/共99页非手术法收集胚胎第27页/共99页第28页/共99页(五五)胚胎的检查胚胎的检查第29页/共99页第第6 6天收集的胚胎（未拣）天收集的胚

9、胎（未拣）1、检胚第30页/共99页二细胞至四细胞胚胎二细胞至四细胞胚胎 第31页/共99页2、胚胎鉴定 荧光活体染色体 醋醋酸酸荧荧光光素素（FDAFDA，fluoresceindiacetate），培培养养3-63-6，活活胚胚胎显示荧光，死胎无荧光。胎显示荧光，死胎无荧光。测定代谢活性法 1h1h测定葡萄糖的消耗量测定葡萄糖的消耗量2-5g2-5g以上。以上。形态学法第32页/共99页原核 8细胞正常胚胎第33页/共99页桑椹胚早期囊胚第34页/共99页异常胚胎示意图未受精卵未受精卵胞质中有空泡第35页/共99页卵裂球脱落卵裂球分散卵裂球不规则受精卵退化第36页/共99页透明带破裂透明带

10、不规则卵圆形透明带第37页/共99页 胚胎的移植胚胎的移植 手术法：各种家畜各种家畜 非手术法：牛、马牛、马第38页/共99页第39页/共99页(七七)供体和受体的观察供体和受体的观察健康状况；健康状况；是否发情。是否发情。第40页/共99页 六、胚胎移植目前存在的问题六、胚胎移植目前存在的问题和发展前景。和发展前景。1 1、超排效果不够稳定。、超排效果不够稳定。2 2、胚胎回收率低。、胚胎回收率低。3 3、移植成功率低、移植成功率低50-60%.50-60%.(一)问题第41页/共99页(二二)发展前景发展前景 1 1、提高稳定超排效果。、提高稳定超排效果。2 2、改进非手术法收集和移植胚胎

11、、改进非手术法收集和移植胚胎 的技术和器具的技术和器具.3 3、胚胎移植技术应与胚胎切割、胚胎冷冻、胚胎移植技术应与胚胎切割、胚胎冷冻、早期胚胎的性别鉴定等结合起来。早期胚胎的性别鉴定等结合起来。第42页/共99页第二节第二节 胚胎冷冻与体外受精胚胎冷冻与体外受精 (一一)意义意义 1 1、建立胚胎库，保存优良种畜与濒危动物资源。、建立胚胎库，保存优良种畜与濒危动物资源。2 2、使胚胎移植不受时间与地点的限制。、使胚胎移植不受时间与地点的限制。3 3、胚胎运输取代种畜引进。、胚胎运输取代种畜引进。一、胚胎冷冻第43页/共99页(二二)冷冻原理冷冻原理形成冰晶胞外水分渗透压升高细胞脱水、蛋白质变

12、性胞内水分形成大的冰晶细胞死亡胞外溶液效应抗冻保护剂胞内形成大的冰晶胞外溶液效应第44页/共99页冷冻保护剂：甘油、冷冻保护剂：甘油、DMSODMSO、乙二醇、丙二醇。乙二醇、丙二醇。第45页/共99页(三三)冷冻及解冻方法冷冻及解冻方法 1、缓慢降温法 以低于以低于0.2-0.8/min0.2-0.8/min速度降低到速度降低到7070 再投入液氮，解冻速度也不超过再投入液氮，解冻速度也不超过25/min25/min优点：脱水完全，细胞内不易形成冰晶优点：脱水完全，细胞内不易形成冰晶缺点：费时，需要特殊仪器缺点：费时，需要特殊仪器第46页/共99页 2、快速冷冻，快速解冻胚胎采集洗涤加甘油中

13、平衡20装管0平衡10以1/分降至-6-7并平衡10以0.3-0.5/min降至-35-38后投入液氮。投入37水中解冻1，然后用蔗糖PBS液洗2次。第47页/共99页第48页/共99页 3、一步冷冻法采采用用25%25%的的甘甘油油、丙丙二二醇醇、乙乙二二醇醇中中的的任任何何两两种种保保护护剂剂组组成成高高浓浓度度的的玻玻璃璃化化液液，分分两两步步移移入入低低、高高浓浓度度的的保保护护剂剂中中，装装管管并并在在44平平衡衡1010然然后后投投入入液液氮氮。（DMSODMSO对胚胎的毒性很大）对胚胎的毒性很大）第49页/共99页2525%2525%甘甘油油13 13 25%25%甘甘油油、蔗蔗

14、糖糖104 104 25%25%甘甘油油、25%25%丙丙二二醇醇3030液氮液氮解解冻冻：胚胚胎胎2525水水温温蔗蔗糖糖55保保存存液液冲洗冲洗3-43-4装枪移植。装枪移植。第50页/共99页二、体外受精二、体外受精(一一)卵母细胞体外成熟卵母细胞体外成熟 1、采卵：剖剖腹腹、腹腹腔腔镜镜、屠屠宰宰场场 卵子分四类卵子分四类 形态正常，卵丘细胞致密形态正常，卵丘细胞致密 卵丘细胞部分脱落卵丘细胞部分脱落 卵丘细胞全部脱落：裸卵卵丘细胞全部脱落：裸卵 卵子已退化卵子已退化第51页/共99页 2、未成熟卵子的培养TCM-199+TCM-199+胎胎牛牛血血清清+丙丙酮酮酸酸，可可加加cAMP

15、cAMP、血血清清、生生长长因因子子、生生殖殖激激素素(FSH(FSH、17-17-雌雌二二醇，醇，hCG)hCG)39 5%CO2 39 5%CO2饱和湿度饱和湿度20-30h20-30hM199+PMSG10/ml+hCG10/mlM199+PMSG10/ml+hCG10/ml 17-17-雌二醇雌二醇1mg/L1mg/L 10%10%猪卵泡液猪卵泡液10%FSC+10%FSC+半胱氨酸半胱氨酸69mg/L69mg/L第52页/共99页培养成熟牛卵母细胞第53页/共99页(二二)精子体外获能精子体外获能 1、精子洗涤：多次离心 2、精子获能 BOBO液液咖咖啡啡因因，肝肝素素、BSABSA

16、、钙钙离离子子载载体体 改良改良Tyrode10mg/mlTyrode10mg/ml肝素肝素第54页/共99页(三三)体外受精体外受精微滴：微滴：5-105-10个个卵卵母母细细胞胞加加0.64-1106/ml0.64-1106/ml精精子子395%CO2395%CO2气气体体Tyride18-24h Tyride18-24h BO BO 6-6-8h8h第55页/共99页第56页/共99页 液滴示意图第57页/共99页 卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因此，通常只检查细胞核的成熟。此，通常只检查细胞核的成熟。卵母细胞核染色 制片：压片。固定：固定液

17、乙醇：乙酸3：1，24h 染色：1地衣红，40乙酸 镜检：光学显微镜第58页/共99页制片、固定、染色示意图 第59页/共99页(四四)早期胚胎的体外发育培养早期胚胎的体外发育培养许多动物早期胚胎均存在体外发育阻滞现象。牛磺酸6%mg/L半胱氨酸5%CO2第60页/共99页(五五)精子显微注射精子显微注射指指采采用用显显微微操操作作方方法法将将处处理理后后的的精精子子核核或或完完整整的的精精子子直直接接注注入入卵卵质质，完完成成受受精过程。精过程。细胞流式分类器细胞流式分类器基基本本程程序序：精精子子注注射射前前处处理理：精精子子核核。借借助助显显微微操操作作仪仪将将核核直直接接穿穿过过透透明

18、明带带和和卵卵膜膜进入卵质中；进入卵质中；注射后的卵母细胞体外培养。注射后的卵母细胞体外培养。第61页/共99页胞质内授精（ICSI）第62页/共99页带下授精第63页/共99页第三节第三节 胚胎显微操作胚胎显微操作显微操作仪分割徒手分割 0.1-0.2%链 霉 蛋白酶软化透明带 一、胚胎分割第64页/共99页胚胎分割第65页/共99页第66页/共99页二、细胞核移植二、细胞核移植单单个个卵卵裂裂球球或或体体细细胞胞核核，移移入入去去核核的的成成熟熟卵卵母母细细胞胞中中采采用用一一定定的的方方法法激激活活卵卵母母细细胞胞，使使供供体体核核和和受受体体核核融融合合为为重重构构胚胚，经经移移植植后

19、发育成新个体的技术。后发育成新个体的技术。“多莉多莉”dolydoly第67页/共99页核移植的程序图第68页/共99页克隆技术路线图第69页/共99页第70页/共99页“多莉”doly第71页/共99页显微注射仪第72页/共99页显微注射仪操作臂第73页/共99页显微注射仪操作臂第74页/共99页显微注射仪操作臂第75页/共99页拉针仪第76页/共99页煅烧仪第77页/共99页磨针仪第78页/共99页 核移植技术的操作过程供体核的分离技术 a a、胚细胞、胚细胞胚胎干细胞类胚胎干细胞胚胎干细胞类胚胎干细胞 b b、体细胞、体细胞第79页/共99页受体细胞的去核技术 a a、受精卵：松弛素、受

20、精卵：松弛素 b b、成熟卵母细胞、成熟卵母细胞核卵重组技术：移入供体核卵母细胞的激活与细胞融合核移植胚的培养与移植或重复克隆技术。第80页/共99页三、转基因动物三、转基因动物 是是指指将将外外源源基基因因通通过过显显微微操操作作，整整合合到到某某种种动动物物的的基基因因组组中中，并并使使之在转录及翻译的水平上得以表达，从而改变该物种的生物学特性。之在转录及翻译的水平上得以表达，从而改变该物种的生物学特性。第81页/共99页转基因动物的制备第82页/共99页转基因的意义转基因的意义提高家畜的经济性状，提高家畜的经济性状，以家畜为畜主生产有用的生物活性物质，以家畜为畜主生产有用的生物活性物质，

21、抗病育种，抗病育种，利用转基因猪生产人类所需的器官。利用转基因猪生产人类所需的器官。第83页/共99页转基因动物制备过程第84页/共99页基因导入方法基因导入方法1、显 微 注射第85页/共99页转基因小鼠制备过程第86页/共99页逆转录病毒感染法胚胎干细胞介导法精子载体法第87页/共99页第88页/共99页第四节性别控制技术第四节性别控制技术沉淀法沉淀法 X精子体积较大，沉淀快梯度离心法梯度离心法 X、Y精子DNA含量有差异的原理，X较Y大电泳法电泳法 X、Y精子表面所带电荷的差异 靠近正极X、负极Y 一、精子分离方法第89页/共99页H-YH-Y抗原法抗原法 抗H-Y的抗体处理精子，使Y精

22、子失能精子的柱层析分离法精子的柱层析分离法 葡聚糖凝胶G-50第90页/共99页 X精子的DNA含量略多干Y精子速度慢，受胎率较低，价格昂贵。流式细胞分类器第91页/共99页二、胚胎的性别控制二、胚胎的性别控制细胞遗传学细胞遗传学 核型分析核型分析X X染色体连锁酶活力测定法染色体连锁酶活力测定法 雌雌性性胚胚胎胎X X染染色色体体连连锁锁酶酶的的活活性性是是雄雄性的两倍。性的两倍。H-YH-Y抗原法抗原法第92页/共99页细胞毒性分析法 含含有有H-YH-Y抗抗血血清清与与补补体体的的培培养养液液中中培培养养，有有H-YH-Y抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解。抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解。间

23、接免疫荧光法 先先将将8 8细细胞胞至至囊囊胚胚期期胚胚胎胎与与H-YH-Y抗抗体体反反应应3030分分钟钟，与与FITCFITC标标记记的的IgMIgM抗抗体体反反应应。然然后后在在荧荧光光显显微微镜镜下下检检查查胚胚胎胎是是否否带带有有荧荧光光素素，若若有有为为雄雄性。性。第93页/共99页Y Y染色体特异性染色体特异性DNADNA探针法探针法 用用同同位位素素标标记记的的Y Y染染色色体体特特异异序序列列的的探探针针，用用这这一一探探针针与与从从胚胚胎胎细细胞胞中中提提取取的的少少量量DNADNA杂交。杂交。在在雄雄性性的的DNADNA片片断断，即即SRYSRY（性性别别决决定定区区）与

24、与PCRPCR扩增技术相结合，用于胚胎性别鉴定。扩增技术相结合，用于胚胎性别鉴定。第94页/共99页三、外界环境三、外界环境控制饲养类型及营养水平控制饲养类型及营养水平谷物谷物饲料为主的酸性饲料类型多饲料为主的酸性饲料类型多雄性后代后代青绿青绿饲料为主的饲料类型多饲料为主的饲料类型多雌性后代后代营养不良营养不良时多时多雄性后代后代营养丰富营养丰富时多时多雌性后代后代第95页/共99页控制配制年龄控制配制年龄 过过于于年年老老的的或或过过于于年年轻轻的的母母体体常常多多生雄性生雄性;中年常多生雌性。中年常多生雌性。第96页/共99页交配特点交配特点交配次数 雄雄兔兔于于一一天天中中进进行行多多次

25、次交交配配，发发现现后后代代中的雌性越来越多中的雌性越来越多。受孕时间 发发情情早早期期卵卵子子刚刚排排出出时时受受孕孕后后代代雌雌性性较较多，发情晚期卵子过度成熟后受孕者雄性多。多，发情晚期卵子过度成熟后受孕者雄性多。人工授精时所采用的一些其他方法 在在输输精精前前20-30,20-30,精精氨氨酸酸阴阴道道内内注注入入1ml1ml：高、低高、低雄，中雄，中雌雌第97页/共99页 复习思考题复习思考题名词解释：胚胎移植、细胞核移植、转基因动物、精子显微注射名词解释：胚胎移植、细胞核移植、转基因动物、精子显微注射 、胚胎冷冻、胚胎冷冻 胚胎移植的意义。胚胎移植的意义。胚胎移植的生理学基础。胚胎移植的生理学基础。胚胎移植的基本原则。胚胎移植的基本原则。胚胎移植的技术过程。胚胎移植的技术过程。胚胎移植目前存在的问题和发展前景。胚胎移植目前存在的问题和发展前景。胚胎冷冻的原理。胚胎冷冻的原理。性别控制有哪些技术？性别控制有哪些技术？第98页/共99页感谢您的观看！第99页/共99页