第七章序列测定精选文档.ppt

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1、第七章序列测定本讲稿第一页，共二十四页DNA序列测定：DNA sequencing酶法 或末端终止法：由Sanger 等人1977年建立；化学法：由Maxam and Gilbert 等人1977年建立；自动测序系统：在末端终止法基础上发展而来。本讲稿第二页，共二十四页末端终止法特性：利用DNA聚合酶进行引物延伸反应；其引物是带有放射性标记的，可通过放射自显影检出；双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）作为链终止剂；采用聚丙烯酰胺区分长度仅差一个碱基的单链DNA。原理：双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）不会与正常的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）形成磷酸二酯键，从而链的随机终止；建立4个系统，就可得

2、到4个套组（nested sets）；在一个胶板上同时电泳，就可读出模板链的互补链的顺序。本讲稿第三页，共二十四页双脱氧核糖核苷三磷酸（ddNTP）本讲稿第四页，共二十四页DNADNA的序列测定（的序列测定（1 1）ddNTPddNTP法法Sanger法法本讲稿第五页，共二十四页本讲稿第六页，共二十四页本讲稿第七页，共二十四页化学法测序的基本原理将双链或单链DNA经过不同的化学方法降解，得到随机的短的DNA片段，再通过电泳分离读取顺序。每次只能在一个特定的核苷酸处降解：G反应：硫酸二甲脂（DMS）使鸟嘌呤N7甲基化；A+G反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被嘧啶取代；C

3、+T反应：肼能够裂解嘧啶环，进而导致其脱落；C反应：在一定浓度的条件下，肼只对胞嘧啶起作用本讲稿第八页，共二十四页DNADNA的序列测定（的序列测定（2 2）化学法化学法Maxam/Gilbert法本讲稿第九页，共二十四页本讲稿第十页，共二十四页 到到20302030年，年，预计只要预计只要10001000美金就能得到个人的基因美金就能得到个人的基因组序列。组序列。注：注：人与人之间平均人与人之间平均10001000个碱基对就个碱基对就有一个碱基呈多态性。有一个碱基呈多态性。因此共有因此共有300300万碱万碱基上可能存在差异。基上可能存在差异。本讲稿第十一页，共二十四页DNA序列的自动测定基

4、本原理：末端终止法引物用荧光素标记测序系统由反应系统，电泳系统及驱控系统组成ALF expressTM 全自动激光荧光核酸测序仪 400-500bp per sampleABI最新型全自动DNA测序仪 700 bp per sample本讲稿第十二页，共二十四页DNA自动测序原理本讲稿第十三页，共二十四页本讲稿第十四页，共二十四页本讲稿第十五页，共二十四页DNA自动测序工作站本讲稿第十六页，共二十四页本讲稿第十七页，共二十四页DNADNA测序结果测序结果本讲稿第十八页，共二十四页Pyrosequencing:焦磷酸测序法 仍然根据碱基互补配对的原则 单个核苷酸或碱基按给定顺序发放通过检测焦磷酸

5、发光反应来判断正确的核苷酸顺序 AGGATCTGAGGCAAG TCCTAGAC本讲稿第十九页，共二十四页A New Light on DNAJoJoGene Company Limited本讲稿第二十页，共二十四页PPiATPPrinciple of Principle of P Pyrosequencingyrosequencing本讲稿第二十一页，共二十四页Peak height is proportional to Peak height is proportional to the number of incorporated nucleotidesthe number of inc

6、orporated nucleotidesAllele 1:ACTGAllele 2:GCTGHeterozygote sample:本讲稿第二十二页，共二十四页Advantage and Benefit of PyeosequencingAdvantage and Benefit of PyeosequencingFastAccuracyFlexibilityMultiplexingSimpleSequenceEfficientShort Optimization TimeDedicated SoftwareDedicated Reagent KitScalable本讲稿第二十三页，共二十四页Let Us Show You the Light.Let Us Show You the Light.The EndThank You!JoJoGene Company Limited本讲稿第二十四页，共二十四页