菌种保藏和使用技术.ppt

《菌种保藏和使用技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《菌种保藏和使用技术.ppt（39页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、菌种保藏和使用技术12021/2/23 美国国家菌种保藏中心提供的标准菌株22021/2/23 法国生物梅里埃公司提供的商业派生菌株Bioball)32021/2/23 我所如今保藏的标准储藏菌株42021/2/23 我所以往保藏的标准储藏菌株52021/2/23 我所制备的工作菌株62021/2/23法规法规n n中国药典2005年版n n中国药典年版n n实验室认可准那么n n其他行业标准72021/2/23n n中国药典2005年版n n无菌检查法：灵敏度检查项下n n 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代从菌种保存中心获得的冷冻枯燥菌种为第0代，并采用适宜的菌种保藏技术

2、，以保证试验菌株的生物学特性。n n微生物限度检查法：细菌、霉菌及酵母菌计数项下n n 菌种 同无菌检查法82021/2/23n n中国药典年版中国药典年版n n在方法的附录中对菌种的规定同在方法的附录中对菌种的规定同20052005年版年版n n在新增的在新增的“药品微生物实验室标准指导原那么药品微生物实验室标准指导原那么中对菌种有了较为明确的规定中对菌种有了较为明确的规定n n允许使用标准菌株和商业派生菌株允许使用标准菌株和商业派生菌株n n标准菌株应按保藏机构提供的说明进展复活标准菌株应按保藏机构提供的说明进展复活n n标准储藏菌株应进展纯度和特性确认标准储藏菌株应进展纯度和特性确认n

3、n标准储藏菌株建议采用低温冷冻枯燥、液氮贮存标准储藏菌株建议采用低温冷冻枯燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法或超低温冷冻保藏的方法n n标准储藏菌株可用于制备每月或每周一次转种的标准储藏菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株工作菌株n n冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用n n工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株用作工作菌株92021/2/23n n实验室认可准那么n n检测和校准实验室才能认可准那么在微生物检测领域的应用说明CNAS-CL09n n实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种或参照

4、标本n n标准菌种或标本必须从认可的菌种或标本搜集途径获得。实验室必须建立和保存其所有菌种、标本的搜集、贮藏、保存、确认试验的记录n n实验室应有文件化的程序管理参照菌种从原始菌种到日常工作用菌。该程序应包括：n n参照菌种必须定期转种传代，并做确认试验，包括实验室中所需要的关键诊断指标，实验室必须加以记录并予以保存102021/2/23n n每一支参照菌种都应以适当的标签、标记或其它标识方式每一支参照菌种都应以适当的标签、标记或其它标识方式来表示其名称、标准号、接种日期和所传代数来表示其名称、标准号、接种日期和所传代数n n其管理记录中还应包括但不限于以下内容：其管理记录中还应包括但不限于以

5、下内容：n n从原始菌种传代到工作用菌种的代数；从原始菌种传代到工作用菌种的代数；n n菌种生长的培养基及孵育条件；菌种生长的培养基及孵育条件；n n菌种生存条件。菌种生存条件。112021/2/23n n其他行业标准其他行业标准n n实验室质量控制标准食品微生物检测实验室质量控制标准食品微生物检测GB/T GB/T 27405-27405-n n实验室应制订并施行特定程序管理和使用标准培实验室应制订并施行特定程序管理和使用标准培养物养物n n实验室应通过标准培养物来验收培养基、验证方实验室应通过标准培养物来验收培养基、验证方法和评估实验操作法和评估实验操作n n实验室可使用来自认可的国内或国

6、外菌种保藏机实验室可使用来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌株所有特性等效构的标准菌株，或使用与标准菌株所有特性等效的商业派生菌株的商业派生菌株n n标准菌株传代培养一次，制得标准储藏菌株，同标准菌株传代培养一次，制得标准储藏菌株，同时应进展确认试验。建议使用深度冰冻或冻干的时应进展确认试验。建议使用深度冰冻或冻干的方法制备标准储藏菌株。方法制备标准储藏菌株。n n标准储藏菌株经继代培养获得工作菌株。一旦标标准储藏菌株经继代培养获得工作菌株。一旦标准储藏菌株被解冻，最好不要重新冷冻和再次使准储藏菌株被解冻，最好不要重新冷冻和再次使用。用。n n工作菌株不可替代标准菌株。标

7、准菌株的商业派工作菌株不可替代标准菌株。标准菌株的商业派生菌株仅可用作工作菌株。生菌株仅可用作工作菌株。n n标准菌株发生变化经历证不符合规定应及时销毁。标准菌株发生变化经历证不符合规定应及时销毁。122021/2/23我所的菌种管理规程我所的菌种管理规程n n菌种的采购n n菌种的复苏n n菌种的传代n n菌种的保藏n n菌种的使用和销毁132021/2/23n n菌种的采购n n每年年底，由实验室菌种管理人员提出下一年度菌种采购的方案，方案购置的菌种一般为药典收载的标准菌种，填写请购单，经批准后，由所采购部门向指定的菌种保藏机构购置。n n所购菌种均为冷冻枯燥菌种。n n采购部门购入菌种后

8、，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻枯燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置46暂存。142021/2/23n n菌种的复苏n n菌种在翻开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套翻开用具，严防穿插污染。n n菌种复苏应在生物平安柜内操作。n n大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。n n取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进展鉴定。152021/2/23n n菌种的传代n n应在生物平安柜中进展菌种的传代。n

9、n取经过纯度鉴定的第1代菌种管琼脂培养基斜面培养物用于传代制备第2代菌种。n n接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培养56天，黑曲霉宜培养57天，其他菌种一般培养1824小时。162021/2/23n n菌种的保藏n n保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70-70。n n在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。菌名、菌号、传代日期和有效期。n n所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。n n该方法保藏菌种的

10、有效期规定为该方法保藏菌种的有效期规定为6 6个月个月 。172021/2/23n n菌种的使用和销毁菌种的使用和销毁n n本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二外提供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷冻菌种。代低温冷冻菌种。n n本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领取，并在员领取，并在?菌种领用记录菌种领用记录?上记录菌名、数量、上记录菌名、数量、领用人等信息。领用人等信息。n n外单位向我所购置菌种，应凭单位介绍信，并注外单位向我所购置菌种，

11、应凭单位介绍信，并注明菌名、菌号、数量，必要时可预约购置。明菌名、菌号、数量，必要时可预约购置。n n本所保藏的菌种，一般应每年更换原种每年翻本所保藏的菌种，一般应每年更换原种每年翻开一套冷冻枯燥菌种传代制备第开一套冷冻枯燥菌种传代制备第1 1代原种保存。代原种保存。n n过期菌种应及时销毁，销毁时应经过期菌种应及时销毁，销毁时应经121121 20 20分钟的分钟的生物灭活处理。生物灭活处理。182021/2/23n n我所对外提供菌种时所附的菌种使用说明和发放证明n n 菌种证明年版.doc192021/2/23基层单位可使用的技术基层单位可使用的技术n n通过制备工作菌种进展菌种保藏的方

12、法n n通过制备标准储藏菌种进展菌种保藏的方法202021/2/23n n通过制备工作菌种进展菌种保藏的方法通过制备工作菌种进展菌种保藏的方法n n从我所采购超低温冷冻的标准储藏菌株第二代从我所采购超低温冷冻的标准储藏菌株第二代n n将所购菌株置将所购菌株置4 46 6暂存，并尽快制备工作菌种暂存，并尽快制备工作菌种n n准备足够数量的琼脂斜面培养基准备足够数量的琼脂斜面培养基n n在生物平安柜内取标准储藏菌株在生物平安柜内取标准储藏菌株1 1接种环，划线接接种环，划线接种至斜面上，重复操作直至所有斜面均被接种种至斜面上，重复操作直至所有斜面均被接种n n将所有斜面培养基置适宜的温度培养适宜的

13、时间将所有斜面培养基置适宜的温度培养适宜的时间n n观察培养的情况，取其中观察培养的情况，取其中1 1支进展镜检和必要确实支进展镜检和必要确实认实验认实验n n确认符合要求的工作菌种进展必要的标识，置确认符合要求的工作菌种进展必要的标识，置4 46 6保藏第三代保藏第三代n n在规定的保存期内，取上述斜面培养物用于各种在规定的保存期内，取上述斜面培养物用于各种实验实验n n至失效期前，取其中至失效期前，取其中1 1支重复接种斜面培养基，制支重复接种斜面培养基，制备第四代工作菌种备第四代工作菌种212021/2/23n n通过制备工作菌种进展菌种保藏的方法n n优点n n操作简便n n本钱低n

14、n比较容易掌握n n缺点n n保存期比较短n n反复传代有引起变异的可能222021/2/23从我所采购的第2代超低温冷冻标准储备菌种工作菌种第3代工作菌种第3代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代 通过制备工作菌种进展菌种保藏的形式图232021/2/23n n通过制备标准储藏菌种进展菌种保藏的方法通过制备标准储藏菌种进展菌种保藏的方法n n准备低温冰箱，温度应能到达准备低温冰箱，温度应能到达-30-30，最好可以装，最好可以装备超低温冰箱，温度到达备超低温冰箱，温度到达-70-70n n准备适宜的液体培养基准备适宜的液体培养基n n将采购来的

15、标准储藏菌株在生物平安柜内汲取适将采购来的标准储藏菌株在生物平安柜内汲取适量接种至液体培养基中量接种至液体培养基中n n将培养基置适宜温度培养适宜时间将培养基置适宜温度培养适宜时间n n取适量培养物进展镜检和必要确实认实验取适量培养物进展镜检和必要确实认实验n n确认符合要求后，在生物平安柜内，向上述液体确认符合要求后，在生物平安柜内，向上述液体培养物中参加培养物中参加15152020V/VV/V的无菌甘油，混的无菌甘油，混匀匀n n取取1 12ml2ml上述混合物，置无菌冻存管或无菌离心上述混合物，置无菌冻存管或无菌离心管内管内n n进展必要的标识进展必要的标识n n置低温冰箱中冷冻置低温冰

16、箱中冷冻n n取冻存管取冻存管1 1支，解冻后，制备当月使用的工作菌种支，解冻后，制备当月使用的工作菌种242021/2/23n n通过制备标准储藏菌种进展菌种保藏的方法n n优点n n保存期较长n n反复传代导致菌种变异的风险较小n n缺点n n操作相对复杂n n本钱较高n n操作流程相对较长，受到污染的风险较高252021/2/23从我所采购的第2代超低温冷冻标准储备菌种标准储备菌种第3代标准储备菌种第3代标准储备菌种第3代标准储备菌种第3代标准储备菌种第3代标准储备菌种第3代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌种第4代

17、通过制备标准储藏菌种进展菌种保藏的形式图262021/2/23有关菌种问题的答复有关菌种问题的答复n n阳性菌的制备：领取工作菌种，从斜面上取一定量的培养物，稀释至系列梯度的菌悬液，分别测各梯度菌悬液的菌落数。临用时，取相应稀释菌悬液用于阳性试验，同时用平皿法测定参加的菌液中的菌落数。是否可行？n n对照用菌液的制备应取工作菌种，接种置适宜的液体培养基中，经培养后获得浓菌液，再进展稀释和确定菌浓度272021/2/23n n菌种鉴定n n简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定技术，如API鉴定条n n根本程序为：n n对疑似菌种进展纯培养n n进展染色镜检n n根据染色情况，并结合显色培养基

18、等鉴定的初步信息，选择适宜的鉴定条n n根据操作说明书，得到各生化反响的鉴定结果，通过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果n n也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统282021/2/23n n请教黑曲霉及白色念珠菌详细传代及培养技术，操作中有何注意点？n n采用的培养基应为改进马丁琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基n n传代操作建议在生物平安柜内进展n n白色念珠菌n n斜面培养基的传代：取斜面培养的菌种管，用接种环取1白金耳，在待接种的培养基斜面上划线接种，培养即可n n液体培养基的传代：取液体培养的菌种管，用毛细吸管取适量，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可n n培养条件：2025，

19、24小时292021/2/23n n黑曲霉黑曲霉n n斜面培养基的传代：取斜面培养的菌种管，用斜面培养基的传代：取斜面培养的菌种管，用灭菌水或灭菌生理盐水也可以按照年版药典灭菌水或灭菌生理盐水也可以按照年版药典公示稿的方法公示稿的方法3 35ml5ml洗脱孢子，汲取孢子悬洗脱孢子，汲取孢子悬液，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养液，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可即可n n孢子悬液的传代：取孢子悬液，用毛细吸管取孢子悬液的传代：取孢子悬液，用毛细吸管取适量，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培适量，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可养即可n n培养条件：培养条件：20202525

20、，4 45 5天天n n注意点注意点n n减少形成气溶胶的操作减少形成气溶胶的操作n n佩戴手套和口罩进展操作佩戴手套和口罩进展操作302021/2/23n n生孢梭菌计数：用营养琼脂培养基倒皿，厌氧罐培养长不出来，经确认菌是有活性的，厌氧指示颜色正确，-5，-6，-7均无菌落生长n n对于生孢梭菌的计数，建议将所有稀释级均注对于生孢梭菌的计数，建议将所有稀释级均注皿培养皿培养n n培养中的厌氧环境对生长与否是决定性的培养中的厌氧环境对生长与否是决定性的n n有条件的实验室建议采用厌氧培养工作站有条件的实验室建议采用厌氧培养工作站n n小型的厌氧培养可采用厌氧培养罐，但应严格小型的厌氧培养可采

21、用厌氧培养罐，但应严格按照使用说明操作，注意厌氧试剂、厌氧指示按照使用说明操作，注意厌氧试剂、厌氧指示剂、催化剂的有效性剂、催化剂的有效性312021/2/23n n如何对菌种进展复壮，传代之前是否一定要做微生物学鉴定，确认是否有变异。n n复壮的方法应根据待复壮的菌种的保藏形式来确定。对冻干菌种，复壮操作较为繁琐n n微生物传代中的菌种确认是必须的322021/2/23n n阳性对照是否必须购置菌种？菌种应该怎样保存？有效期一般为多长时间？n n对照用菌种应采用标准菌种，一般应外购n n保存方法如前述n n有效期根据不同菌种，不同的保藏方法而异，如采用斜面移植保藏法，不能形成芽孢的细菌有效期

22、一般为1个月，能形成芽孢的细菌有效期一般为3个月，真菌的有效期为3个月。332021/2/23n n铜绿假单胞菌在半固体培养基中生长不是很好，铜绿假单胞菌在半固体培养基中生长不是很好，应如何保藏较好？应如何保藏较好？n n菌种铜绿假单胞菌保存时放冰箱好还是室温好，菌种铜绿假单胞菌保存时放冰箱好还是室温好，贮存过程中菌种变色是否不能使用？贮存过程中菌种变色是否不能使用？n n因铜绿假单胞菌有运动性，因此在半固体培养基因铜绿假单胞菌有运动性，因此在半固体培养基中穿刺培养后无法形成穿刺线。接种时，将半固中穿刺培养后无法形成穿刺线。接种时，将半固体取出直接在培养基上涂布即可。体取出直接在培养基上涂布即

23、可。n n也可以采用超低温冷冻的方式保藏，效果好也可以采用超低温冷冻的方式保藏，效果好n n斜面保藏的菌种在冰箱中放置应注意控制温度，斜面保藏的菌种在冰箱中放置应注意控制温度，一般不宜低于一般不宜低于4 4，也可以放置在室温中，但应控，也可以放置在室温中，但应控制温度不超过制温度不超过25 25。菌种保存过程中，确实会存。菌种保存过程中，确实会存在色素退化在色素退化 的情况，此时对菌种进展传代培养，的情况，此时对菌种进展传代培养，即可重新表现出色素，仍可使用。即可重新表现出色素，仍可使用。342021/2/23n n今年购置的菌液接种后，生长出来较稀薄，是否因为混匀的关系，但放置菌液的瓶子混匀

24、感觉也不是平安，请问是否有更好的方法，或者是否能仍提供固体培养基的菌种n n建议采用琼脂斜面培养基复壮上述超低温冷冻标准储藏菌株。从这些斜面培养基上取培养物接种，制备工作用浓菌液，其浓度可以得到保证352021/2/23n n短小芽孢杆菌如何鉴定n n通过显微鉴别，为不呈链状排列的杆菌，革兰氏染色为阳性。n n营养琼脂斜面上菌苔光滑，薄，闪光，蔓延，不粘着，常常是浅黄色。n n生化试验可选做明胶穿刺、淀粉水解和硝酸盐复原，结果为明胶缓慢液化，淀粉水解阴性，硝酸盐复原阴性。n n采用API鉴定条，结合染色镜检和接触酶实验等结果362021/2/23n n菌种传代至第5代时，还能不能用该斜面菌种接

25、种制备工作用菌液n n严格讲，这种操作是不符合药典规定的。药典严格讲，这种操作是不符合药典规定的。药典所指的传代次数不超过所指的传代次数不超过5 5代，应该是指用于实验代，应该是指用于实验的工作用菌液。因此，从保藏的角度看，制备的工作用菌液。因此，从保藏的角度看，制备成的斜面保藏菌种只能到第成的斜面保藏菌种只能到第4 4代。代。372021/2/23n n菌种的常识，如菌种的保存、适宜的生长环境及菌种的常识，如菌种的保存、适宜的生长环境及存活时间、常见菌种的形态存活时间、常见菌种的形态n n细菌：细菌：n n斜面保藏法：一般使用营养琼脂培养基，生孢梭斜面保藏法：一般使用营养琼脂培养基，生孢梭菌

26、使用液体硫乙醇酸盐培养基，在菌使用液体硫乙醇酸盐培养基，在30303535培养培养18182424小时。存活时间小时。存活时间1 13 3个月。个月。n n低温冷冻保藏法：一般使用营养肉汤培养基，生低温冷冻保藏法：一般使用营养肉汤培养基，生孢梭菌使用液体硫乙醇酸盐培养基，在孢梭菌使用液体硫乙醇酸盐培养基，在30303535培养培养18182424小时。存活时间至少半年。小时。存活时间至少半年。n n真菌：真菌：n n斜面保藏法：使用改进马丁琼脂培养基，也可使斜面保藏法：使用改进马丁琼脂培养基，也可使用沙氏葡萄糖琼脂培养基，在用沙氏葡萄糖琼脂培养基，在202025 25 培养培养2424小小时至时至5 5天天n n低温冷冻保藏法：使用改进马丁培养基或沙氏葡低温冷冻保藏法：使用改进马丁培养基或沙氏葡萄糖培养基，在萄糖培养基，在202025 25 培养培养2424小时。黑曲霉不小时。黑曲霉不适用液体培养基培养。适用液体培养基培养。382021/2/23谢谢 谢谢392021/2/23