3菌种选育实用.pptx

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1、遗传变异类型第1页/共34页菌种退化变异的原因1.遗传基因型的分离2.自发变异的产生用沙土管等长期保藏菌种连续传代活细胞内进行的新陈代谢DNA中存在的增变基因、死亡基因等引起基因突变3.诱变剂处理后的退化变异初筛菌落不纯诱变菌种是异核体细胞诱变菌种的DNA发生缺失、整合和重排 第2页/共34页自然分离第3页/共34页纯种筛选的选择性标记1排除低产型菌落1.低产型菌落的特征a)光秃型，不产气生菌丝。b)生长势衰退，菌落长得过小。c)菌落表面、孢子生长和颜色等不均匀。d)生长过于旺盛。2.高产型菌落的特征a)孢子生长有减弱趋势。b)菌落大小适中，有偏小趋势，但不是极小。c)菌落偏小，但孢子生长丰满

2、。d)孢子颜色有减弱的趋势。e)沟纹多、密、直而整齐。f)营养菌丝分泌色素或逐渐加深，或逐渐变浅。2摇瓶筛选高产型菌株3遗传基因型纯度考察4传代稳定性试验第4页/共34页抗生素作为诱变剂用于菌种选育l-内酰胺抗生素：抑制细胞壁的合成l多烯类抗生素（制霉菌素、两性霉素B）：作用于细胞膜的Na+K+ATP酶、磷酸转移酶等，损伤含有麦角甾醇等的真菌细胞膜而造成细胞内含物向外泄漏。Eg 制霉菌素处理产黄青霉获得高产青霉素。l大环内酯和氨基环醇类抗生素：抑制mRNA聚合酶、氨酰tRNA合成酶、肽酰基转移酶和各种蛋白质因子的活性来抑制蛋白质合成，从而干扰生物体的正常复制l抗肿瘤抗生素：使微生物菌种的细胞壁

3、、细胞质膜、核酸和蛋白质的生物合成系统发生变化而得到突变株。E.g.丝裂霉素C处理春日霉素产生菌获得高产突变株。第5页/共34页诱变处理过程中的几个有关问题1.诱变剂诱变剂的选择：各种诱变剂交替使用。诱变剂量的选择：7599.9致死率。增变剂的选择：氯化锂 孢子萌发 增强uv的诱变效果。8-甲氧基补骨脂素长波紫外线，吸收其能量而与DNA分子中胸腺嘧啶结合。获得麦白霉素高产菌株。第6页/共34页补骨脂素与DNA中碱基的作用第7页/共34页2.影响诱变效果的因素出发菌株的选择：纯、稳定对菌种生理特性的要求：新鲜培养的斜面孢子、预萌发的孢子单孢子悬浮液诱变处理时的外部条件：UV：避光NTG:不能用p

4、H中性的buffer碱基类似物：合成培养基添加碱基类似物第8页/共34页高单位菌种选育方法的进阶方法处理方法筛选方案的设计随机筛选紫外线（UV）、亚硝基胍（NTG）1.直接摇瓶筛选2.琼脂块预筛选3.自动化筛选半理性化筛选紫外线、亚硝基胍、原生质体再生、融合等1.去代谢物调节突变株的筛选(1)耐前体及其类似物突变抹的筛选(2)耐自身产物及其类似物突变株的筛选(3)耐金属离子突变株的筛选(4)耐分解阻遏物突变株的筛选(5)耐磷酸盐突变株的筛选2.形态突变株的筛选3.膜渗透性突变株的筛选4.代谢途径障碍突变株的筛选5.抗生素酶缺失突变株的筛选6.抗次级代谢产物生物合成酶抑制剂突变株的筛选7.初级代

5、谢酶高活力突变株的筛选8.适应酶系统调节突变株的筛选理性化筛选生物合成基因、抗性基因、启动于等DNA的转化筛选带有抗生素抗性基因或其他遗传标记的转化子第9页/共34页琼脂块筛选方法第10页/共34页第一轮：一个出发菌株200个单菌落初筛每株1瓶复筛每株35瓶5株第二轮：5个菌株诱变剂处理5 X 40株初筛每株1瓶50株复筛每株35瓶5株第三、第四轮：同第二轮诱变剂处理50株摇瓶筛选流程1第11页/共34页摇瓶筛选流程2第一轮：一个出发菌株诱变剂处理200个单菌落初筛每株1瓶2030株复筛每株3瓶23株3株菌株自然分离3 X 50株初筛每株1瓶2030株2030株复筛每株3瓶23株第二轮：重复第

6、一轮第12页/共34页发酵过程中所用的一些前体物质前 体产 物产 生 菌苯乙酸及其类似物苯氧乙酸氮氯正丙醇丙酸盐氰化物-紫罗酮-氨基丁酸D-苏氨酸邻氨基苯甲酸甘氨酸青霉素G青霉素V金霉素灰黄霉素红霉素核黄素维生素B12类胡萝卜素L-异亮氨酸L-异亮氨酸L-色氨酸L-丝氨酸产黄青霉产黄青霉生金链霉菌灰黄链霉菌红霉素链霉菌保加利亚乳酸杆菌丙酸杆菌布拉氏须霉枯草芽孢杆菌粘质赛氏杆菌Hansenula anomalaglycinophilam棒状杆菌第13页/共34页筛选过量合成末端代谢产物的抗性突变株的结构类似物积累的产物(gL)结构类似物积累的产物（g/L）结构类似物苏氨酸(14)-氨基-羟戊酸苯

7、丙氨酸对-氟苯丙氨酸，噻吩丙氨酸酪氨酸对-氟苯丙氨酸；D-酪氨酸色氨酸5-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸、5-氟色氨酸脯氨酸3，4-脱氢脯氨酸组氨酸(8)2-噻唑丙氨酸、1，2，4-三唑-3-丙氨酸缬氨酸-氨基丁酸异亮氨酸(15)缬氨酸、异亮氨酸、氧肟酸亮氨酸三氟亮氨酸、4-氮亮氨酸-氨基丁酸、-氨基-羟戊酸、O-甲基苏氨酸精氨酸(20)刀豆氨酸、精氨酸轻肟、D-精氨酸甲硫氨酸乙硫氨酸，正亮氨酸、-甲基甲硫氨酸、L-甲硫氨酸-D,L-硫肟腺嘌呤2,6-二氨基嘌呤次黄嘌呤、次黄苷5-氟尿嘧啶8-氮鸟嘌呤尿嘧啶5-氟尿嘧啶8-氮黄嘌呤烟酸、砒哆醇（维生素B6）3-乙酰吡啶异烟肼对-氨基苯甲酸磺胺硫胺素

8、（维生素B1）吡啶硫胺素第14页/共34页缬氨酸生物合成第15页/共34页氨基酸生物合成中的反馈抑制第16页/共34页氯霉素反馈阻遏芳基胺合成酶第17页/共34页谷氨酸棒杆菌的野生型（左）和dapD突变株（右）细胞的电镜照片 第18页/共34页初级代谢途径障碍突变导致次级代谢物高产第19页/共34页菌株演变系谱Aurodox(g/ml)抗性程度(g/ml)原始亲株50050“0”变种050回复突变株60050抗性突变株1600400抗性突变株2100900抗性突变株23001300抗性突变株25002000uvuvSRSRSRSRS.goldiniensis的产量和自我抗性第20页/共34页存

9、在于抗生素产生菌中的抗生素修饰酶 产生菌抗生素产物抗生素修饰酶灰色链霉菌链霉素APH(6)比基尼链霉菌链霉素APH(6)谈青链毒菌羟链霉素APH(6)弗氏链霉菌新霉素APH(3)十AAC(3)变青链霉菌青紫霉素APH(3)十AAC(3)核糖苷链霉菌核糖霉素APH(3)十AAC(3)卡那霉素链霉菌卡那霉素AAC(6)黑暗链霉菌妥布拉霉素AAC(6)十AAC(2)吸水链霉菌潮毒索磷酸转移酶S.vinacecus紫紫霉素VPH缠绕链霉菌缠霉素磷酸转移酶、乙酰转移酶APH氨基糖苷磷酸转移酶，AAC氨基糖苷乙酰转移酶；VPH紫霉；素磷酸化酶第21页/共34页抗生素酶缺失突变株的筛选青霉素酶缺失突变株含青

10、霉素及鉴定菌的上层软琼脂金黄色葡萄球菌（鉴定菌）产青霉素酶菌株第22页/共34页生金色链霉菌龟裂链霉菌红霉素链霉菌诺尔斯氏链霉菌灰色链霉菌白色链霉菌金霉素土霉素红霉素制霉菌素克念菌素盐霉素异柠檬酸脱氢酶H果糖-双磷酸醛缩酶H乙酰-CoA羧化酶HH甲基丙二酰CoA转羧酶H磷酸烯醇丙酮酸羧化酶HH丙酸激酶H丙酮酸脱羧酶H磷酸酶H磷酸二酯酶H蛋白酶H腺苷二磷酸酶H脂肪酶H菌种酶活酶产物高产变种中初级代谢途径的某些酶活第23页/共34页某些微生物对生长因素的需要微 生 物生长因素需要量(gm1)弱氧化醋酸杆菌醋酪酸梭状芽孢杆菌干酪乳杆菌第III型肺炎球菌弱氧化醋酸杆菌阿拉伯聚糖乳杆菌肠膜状明串珠菌干酪

11、乳杆菌金黄色链球菌粪链球菌肠膜状乳杆菌阿拉伯聚糖乳杆菌白喉棒状杆菌粪链球菌阿拉伯聚糖乳杆菌戴氏乳杆菌破伤风梭状芽孢杆菌对氨基苯甲酸同上生物素胆碱烟碱酸。同上吡哆醛麻黄素硫胺叶酸胱氨酸泛酸-丙氨酸精氨酸甲硫氨酸色氨酸胸腺苷尿嘧啶00.010.000150.001630.10.0250.050.000520050.021.5501080204第24页/共34页几种主要的维生素及其功能维 生 素功 能对氨基苯甲酸叶酸的前体叶酸碳代谢；甲基转移生物素脂肪酸的生物合成，-脱羧作用，CO2固定，氢原子的载体维生素B12单碳碎片的还原和转移硫辛酸丙酮酸盐和-氧代戊二酸盐的脱羧作用中酰基的转移烟酸(抗赖皮病维

12、生素)NAD的前体；氧化还原反应中的电子转移泛酸CoA的前体，乙酰基和其它的酰基衍生物的活化作用硫胺素（B1）-脱羧作用，酮糖转移酶维生素B6（吡哆醛-吡哆胺基）氨基酸和酮酸的转换维生素K组；醌电子传递第25页/共34页刺激抗生素等生物合成的刺激剂或效应物刺激剂或效应物抗生素刺激剂或效应物抗生素-吲哚乙酸金霉素苯丙氨酸圆弧菌素-萘乙酸金霉素激素类圆弧菌素(醇)硫氰酸苄酯金霉素对氨基苯甲酸诺尔丝菌素甲硫氨酸头孢菌素C甲基化抑制剂脱甲基莫诺霉素正亮氨酸头孢菌素C环糊精兰卡霉素氨头孢菌素C丙氨酸-异亮氨酸阿弗米丁巴比妥链霉素色氨酸麦角固醇类利福霉素细胞色素P450麦角固醇类加利红菌素第26页/共34

13、页初级代谢和次级代谢分叉中间体分叉中间产物初级代谢主要终产物次级代谢产物分支酸色氨酸苯丙氨酸酪氨酸对-氨基苯甲酸氯霉素绿脓素丙二酰辅酶A脂肪酸灰黄霉素四环素棒曲霉素放线菌酮甲羟戊酸类固醇赤霉素-胡萝卜素萜麦角碱、L-氨基已二酸赖氨酸青霉素头孢菌素乙酰乳酸缬氨酸亮氨酸泛酸四甲基吡嗪第27页/共34页参与次级代谢产物生物合成的酶受不同分解代谢物调节的实例 次级代谢产物酶调节机制具有调节作用的分解代谢物去调节作用的分解代谢物菌 种放线菌素吩恶嗪酮合成酶羟基犬尿氨酸酶犬尿氨酸甲酰胺酶II色氨酸加氧酶阻遏阻遏阻遏阻遏葡萄糖葡萄糖、甘油葡萄糖、甘油葡萄糖、甘油半乳糖果糖果糖果糖抗生链霉菌小小链霉菌小小链霉

14、菌小小链霉菌新霉素磷酸酯酶阻遏葡萄糖费氏链霉菌嘌呤霉素0-脱甲基嘌呤霉素甲基转移酶阻遏葡萄糖甘油白黑链霉菌卡那霉素N-酰基卡那霉素水解酶阻遏葡萄糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、乳糖卡那霉素链霉菌链霉素甘露糖苷链霉素酶阻遏葡萄糖、糊精、半乳糖、甘露糖、半胱氨酸、甲硫氨酸灰色链霉菌链霉素磷酸酯酶抑制磷酸盐费氏链霉菌链霉素脒基转移酶阻遏硝酸盐费氏链霉菌第28页/共34页实例续1头孢菌素头孢菌素C乙酰水解酶阻遏葡萄糖、麦芽糖、蔗糖甘油、琥珀酸顶头孢霉青霉素环化酶阻遏葡萄糖蔗糖脱乙酰氧头孢菌素C合成酶 阻遏葡萄糖杀念珠菌素PABA合成酶阻遏磷酸盐灰色链霉菌四环素 脱水四环素加氧酶阻遏磷酸盐金霉素链霉菌泰乐菌素

15、DTDP-葡萄糖4，6-脱氢酶阻遏磷酸盐链霉菌dTDP-mycarose合成酶大菌素甲基化酶麦角生物碱类裸麦角碱环化酶阻遏磷酸盐麦角菌属放线菌素犬尿氨酸甲酰胺酶II阻遏谷氨酸、苯丙氨酸小小链霉菌第29页/共34页具有工业重要性的酶诱导物酶诱 导 物微 生 物-淀粉酶淀粉麦芽糖曲霉枯草芽孢杆菌支链淀粉酶麦芽糖产气气杆菌6-甘露糖苷酶酵母甘露聚糖灰色链霉菌青霉素酰基转移酶苯乙酸大肠杆菌蛋白酶各种蛋白质枯草杆菌，链球菌，链霉菌，曲霉，毛霉纤维素酶纤维素绿色木霉果胶酶果胶（甜菜胶、苹果胶、柑桔皮）曲霉第30页/共34页参与抗生素生物合成调节的诱导物诱导物名称结 构来 源被诱导产生的抗生素A因子，2-异

16、辛酰-3羟甲基-丁内酯链霉菌属放线菌属诺卡氏菌属 链霉素，解白血霉素B因子，3-2-磷酸丁酰-腺苷酵母膏利福霉素I因子，反-2-(6-甲 基-1-庚醇-烷基)3-羟甲基-4-丁内酯绿色产色链霉菌 ZIMET43683 解白血霉素第31页/共34页诱导物续1L因子，4，5-二羟基癸酸-4-内酯灰色链霉菌解白血霉素Grafe因子比基尼链霉菌解白血霉素VB因子，(A，B，C)2-(羟基烷基)-3-(羟甲基)丁内酯维及尼亚链霉菌 维及尼霉素头孢菌素C，A、B因子B因子分子量242，分子式C10H14O5N2产黄青霉ATCC14553 头孢菌素C瓜氨酸Bicozamycin第32页/共34页冷 冻 干 燥 保 藏菌 种第33页/共34页谢谢您的观看！第34页/共34页