基因工程的基本操作程序最终57305.pptx

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1、1-21-2：基因工程的基本操作程序：基因工程的基本操作程序专题专题1 1：基因工程：基因工程原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点启动子启动子终止子终止子不能转录不能转录为信使为信使RNARNA，不能编码不能编码蛋白质蛋白质：能：能转录转录相应的信使相应的信使RNARNA，能，能编码编码蛋白质蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区有有调控调控遗传信息表达的遗传信息表达的核苷酸序列：核苷酸序列：启动子、启动子、一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片断，基因的首

2、端，是片断，基因的首端，是RNARNA聚合酶识别和结聚合酶识别和结合部位合部位，驱动基因转录驱动基因转录启动子启动子终止子终止子一段有特殊结构的一段有特殊结构的DNADNA片断，基因的尾端，使片断，基因的尾端，使转录终止转录终止终止子终止子真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 编码区编码区非编码区非编码区能能编码编码蛋白质的序列蛋白质的序列非编码序列：非编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子不能编码不能

3、编码蛋白质的序列蛋白质的序列内含子：内含子：外显子：外显子：不能转录不能转录为信使为信使RNARNA，不能编码不能编码蛋白质蛋白质有有调控调控遗传信息表达的遗传信息表达的核苷酸序列：核苷酸序列：启动子、启动子、终止子终止子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较思思考考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？细

4、胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定一、目的一、目的基因基因的获取的获取主要是主要是编码蛋白质的结构基因编码蛋白质的结构基因基因工程基本操作的步骤基因工程基本操作的步骤 如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因抗虫基因抗虫基因，还有植物的，还有植物的，还有植物的，还有植物的

5、抗病（抗病抗病（抗病抗病（抗病抗病（抗病毒、抗细菌）基因毒、抗细菌）基因毒、抗细菌）基因毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因种子贮藏蛋白的基因种子贮藏蛋白的基因种子贮藏蛋白的基因，以及人的，以及人的，以及人的，以及人的胰岛素胰岛素胰岛素胰岛素基因、干扰素基因基因、干扰素基因基因、干扰素基因基因、干扰素基因等。等。等。等。二、获取目的基因的常用方法有哪些二、获取目的基因的常用方法有哪些?（一）从基因文库中获取（一）从基因文库中获取（二）利用（二）利用PCRPCR技术扩增技术扩增（三）人工合成（三）人工合成（一）从基因文库中获取目的基因（一）从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多将

6、含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNADNADNA片断，导入到片断，导入到片断，导入到片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为同基因，称为同基因，称为同基因，称为基因文库基因文库基因文库基因文库。1、分类、分类 基因文库基因文库 （gene library）基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如cDNA文库）文库）基因组文库基因组文库:包含了一种生物包含了一种

7、生物所有的所有的基因的基因文库基因的基因文库部分基因文库部分基因文库:包含了一种生物的包含了一种生物的一部分一部分基因的基因文库基因的基因文库 部分基因组文库部分基因组文库cDNA(cDNA(互补互补DNA)DNA)：是由生物的某一特定器官或是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的特定发育时期细胞内的mRNAmRNA经体外反转录后形成的互补经体外反转录后形成的互补DNADNA片段，与载体连接后储片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的受体菌群就叫做这种生物的cDNAcDNA文库文库 如如cDNAcDNA文库文库 (cDNA library

8、(cDNA library)基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNAcDNA文库和基因组文库的对比文库和基因组文库的对比2.2.基因文库的构建方法基因文库的构建方法1.从生物中直接获取从生物中直接获取2.人工合成人工合成（真核生物）（真核生物）(1)(1)反转录法反转录法(2)(2)(2)(2)化学合成法：根据已知的化学合成法：根据已知的化学合成法：根据已知的化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成氨基酸序列合成氨基酸序列合成氨基酸序列合成DNADNADNADNA法法法法：鸟枪法，：鸟枪法，多用于原核生物多用于原核生物1.1.直接分离基因直接分离基因鸟枪法（散弹射击法）鸟枪

9、法（散弹射击法）运载体运载体供体细胞中供体细胞中DNA许多许多DNA片段片段载入载入导入导入受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状目的基因目的基因分离分离外源外源DNA 扩增扩增该法最大的缺该法最大的缺点是点是带有很大的盲带有很大的盲目性，工作量大，目性，工作量大，成功率低。成功率低。用用限制酶限制酶切断成切断成许多片段许多片段。目的基因的目的基因的mRNA单链单链cDNA反转录酶反转录酶双链双链DNA（即目的基因双链（即目的基因双链cDNA）DNA聚合酶聚合酶(1)(1)反转录法反转录法蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸

10、序列目的基因目的基因推测推测化学合成化学合成推测推测2.2.人工合成基因法人工合成基因法(2)(2)(2)(2)化学合成法：根化学合成法：根化学合成法：根化学合成法：根据已知的氨基酸序列据已知的氨基酸序列据已知的氨基酸序列据已知的氨基酸序列合成合成合成合成DNADNADNADNA法法法法合成的基因中均无内含子和启动子合成的基因中均无内含子和启动子杂交双链（杂交双链（RNA-DNA)核酸酶核酸酶H上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点鸟枪法鸟枪法反转录法反转录法根据已知氨基酸根据已知氨基酸合成合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使

11、用工作量大，盲目，分工作量大，盲目，分离出来的有时并非一离出来的有时并非一个基因个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技术条件较高术条件较高专一性强专一性强仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对较少的简单基因较少的简单基因如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息依据：目的基因的有关信息如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质基因翻译产物蛋白质等特性。等特性

12、。3 3、基因文库的目的、基因文库的目的为了在为了在不知目的基因序列不知目的基因序列的情况下，便于获得的情况下，便于获得所需的目的基因。所需的目的基因。已知已知目的基因序列时目的基因序列时2 2、人工合成：、人工合成：基因比较小，核苷酸序列已知基因比较小，核苷酸序列已知基因比较小，核苷酸序列已知基因比较小，核苷酸序列已知DNA合成仪3 3、PCRPCR技术扩增目的基因：技术扩增目的基因：PCR聚合酶链式反应聚合酶链式反应 是一项生物是一项生物体外复制体外复制特定特定DNA片段的核酸合成片段的核酸合成技术技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。通过此技术，可获取大量的目的基因。循环循环变性变性退

13、火退火延伸延伸 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_ _ 前提条前提条件件 _、_ _、_._.原理：原理：_方式：方式：以以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）指数指数2 2n n使目的基因的片段在使目的基因的片段在

14、短时间短时间内成百万倍地扩增内成百万倍地扩增(二二)利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_ _。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_ _ _。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d、循环、

15、循环1、目的：、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用基因能够表达和发挥作用。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 基因工程的核心基因工程的核心2 2、基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因标记基因+复制原点复制原点目的基因：目的基因：外源外源DNA分子的有效片段分子的有效片段启动子：启动子：RNA聚合酶识别和结合部位，聚合酶识别和结合部位，驱动基因转录出驱动基因转录出mRNA终止子：终止子：提供转录终止信号提供转

16、录终止信号标记基因：标记基因：鉴别受体细胞中是否含有鉴别受体细胞中是否含有目的基因目的基因复制原点：复制原点：DNA复制的固定起始点复制的固定起始点二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建核心核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两

17、部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意三、将目的基因导入受体细胞三、将

18、目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化：将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_ _和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达（二）方法（二）方法1 1、将目的基因导入植物细胞的方法：、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：农杆菌特点：易感染易感染双子叶植物和裸子植物双子叶

19、植物和裸子植物，对大多，对大多数单子叶植物没有感染能力数单子叶植物没有感染能力原理：原理：Ti质粒上的质粒上的T-DNA可以转可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的色体的DNA上。上。过程：过程：优点优点:比较经济和有效比较经济和有效（2）基因枪法基因枪法（3）花粉管通道法花粉管通道法2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法 程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显取卵（受精卵）显微注射微注射 受精卵受精卵 新性状动物胚胎新性状动物胚胎早期培养早期培养3 3、将目的基因导入微生物细

20、胞、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：感受态细胞法（方法：感受态细胞法（Ca2+处理法）处理法）用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNA分子分子四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因.首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.将含目的基因的将含目

21、的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位素等作标记素等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法:DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:归纳步骤4 4、个体生物学水平鉴定、个体生物学水平鉴定2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成、检测目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法:分分 子子 杂杂 交交方法方法:抗原抗

22、体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若若出现杂交带出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA归纳步骤归纳归纳:基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1 1、获取目的基因、获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2 2、构建基因表达载体、构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、感受态细胞法农杆菌转化法、显微注射法、感受态细胞法4 4、目的基

23、因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：个体水平的鉴定鉴定：个体水平的鉴定练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a

24、”或或“b”）aa1基因工程的正确操作步骤是基因工程的正确操作步骤是()使目的基因与载体相结合使目的基因与载体相结合将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞验证目的基因的表达是否符合特定性状验证目的基因的表达是否符合特定性状要求要求提取目的基因提取目的基因A BC DC2下列获取目的基因的方法中需要模板的是下列获取目的基因的方法中需要模板的是()从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因利用利用PCR技技术扩增目的基因术扩增目的基因反转录法反转录法通过通过DNA合合成仪利用化学方法人工合成成仪利用化学方法人工合成DNAA BC DD3 3聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)(PCR

25、)是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的技片段的技术。术。PCRPCR过程一般经历下述过程一般经历下述3030多次循环：多次循环：9595下使模板下使模板DNADNA变变性、解链性、解链55 55 下复性下复性(引物与引物与DNADNA模板链结合模板链结合)72 72 下下引物链延伸引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关。下列有关PCRPCR过程的过程的叙述中不正确的是叙述中不正确的是()A A变性过程中破坏的是变性过程中破坏的是DNADNA分子内碱基对之间的氢键，也可分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现利用解旋酶实现B B复性过程中引物与复性过

26、程中引物与DNADNA模板链的结合是依靠碱基互补配对模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成原则完成C C延伸过程中需要延伸过程中需要DNADNA聚合酶、聚合酶、ATPATP、四种核糖核苷酸、四种核糖核苷酸D DPCRPCR与细胞内与细胞内DNADNA复制相比所需酶的最适温度较高复制相比所需酶的最适温度较高C4(2011年重庆高二检测年重庆高二检测)下列关于基因表达载体构下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是建的相关叙述，不正确的是()A需要限制酶和需要限制酶和DNA连接酶连接酶B必须在细胞内进行必须在细胞内进行C抗生素抗性基因可作为标记基因抗生素抗性基因可作为标记基因D启动子位于目的基

27、因的首端启动子位于目的基因的首端B我国中科院上海生化所合成了一种具有镇痛作用而又我国中科院上海生化所合成了一种具有镇痛作用而又不会像吗啡那样使病人上瘾的药物不会像吗啡那样使病人上瘾的药物脑啡肽多糖脑啡肽多糖(类类似于人体中的糖蛋白似于人体中的糖蛋白)。在人体细胞中糖蛋白必须经过。在人体细胞中糖蛋白必须经过内质网和高尔基体的进一步加工才能形成。如果要采内质网和高尔基体的进一步加工才能形成。如果要采用基因工程和发酵工程技术让微生物来生产脑啡肽多用基因工程和发酵工程技术让微生物来生产脑啡肽多糖，应该用下列哪种微生物作受体细胞糖，应该用下列哪种微生物作受体细胞()A大肠杆菌大肠杆菌 B酵母菌酵母菌CT4噬菌体噬菌体 D大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒B