细胞与组织化学幻灯片.ppt

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1、细胞与组织化学第1页，共111页，编辑于2022年，星期一第一章第一章 概概 述述第一节概述第二节组织细胞化学的发展史第2页，共111页，编辑于2022年，星期一第一节概述概述1.组织化学和细胞化学组织化学和细胞化学 组织化学是研究整个组织，而细胞化学是研究单个细胞。细胞和组织化学中的科学组织化学是研究整个组织，而细胞化学是研究单个细胞。细胞和组织化学中的科学技术为细胞和组织中定位特定的化合物提供了方法。技术为细胞和组织中定位特定的化合物提供了方法。Eg.Eg.组组织织切切片片与与目目标标酶酶的的底底物物一一起起孵孵育育，这这一一反反应应的的产产物物与与存存在在于于孵孵育育混混合合物物中中的的

2、色色素素发发生生反反应应。如如果果样样品品在在孵孵育育前前固固定定的的很很好好，且且固固定定过过程程没没有有对对酶酶造造成成损损伤伤，那那么么这这个个过过程程将将会会使使组组织织薄薄片片中中含含酶酶的的细细胞胞在在显显微微镜镜下下显显现现。若若显显微微镜镜具具有有更更高高的的分分辨辨率，还可以将含有该酶的亚细胞器显现。率，还可以将含有该酶的亚细胞器显现。组组织织化化学学（histochemistry)histochemistry)和和细细胞胞化化学学（cytochemistrycytochemistry）技技术术的的基基本本原原理理是是在在组组织织切切片片上上或或被被检检材材料料上上，加加一一

3、定定试试剂剂，使使它它与与组组织织或或细细胞胞中中待待检检物物质质发发生生化化学学反反应应成成为为有有色色沉沉淀淀物物，以以用用光光镜镜观观察察，若若为为重重金金属属沉沉淀淀，可可以以用用电电镜镜观观察察，称称电电镜镜组组织织化化学学（electron electron microscope microscope histochemistry)histochemistry)。这这种种方方法法可可用用于于检检测测细细胞胞内内的的酶酶类类、糖糖类类、脂脂类类。核核酸酸与与某某些些多多属属元元素素等等。如如进进一一步应用显微分光光度计等测定标本中沉淀物的强度，则能较精确地进行定量研究。步应用显微分光

4、光度计等测定标本中沉淀物的强度，则能较精确地进行定量研究。2.2.研究组织、细胞传统的化学方法研究组织、细胞传统的化学方法第3页，共111页，编辑于2022年，星期一 糖类显示法 最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖的方法是过碘酸-雪夫反应（periodic acid Schiff，PAS反应)。基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸（HIO4)氧化后，形成2-醛基；后者与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结合，形成紫红色反应产物,PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。酶类显示酶类显示 细胞内含有多种酶,每一种酶可催化一定的化学反应。酶的显示法是通过显示酶的活性来表明酶的存在，而不是酶的本身。

5、将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液中孵育，底物经酶的作用形成初级反应产物，它再与某种捕捉剂相反应,形成显微镜下可视性沉淀,即最终反应产物。如欲显示细胞内酸性磷酸酶,先将切片放入含有酶底物(常用-甘油磷酸钠)的溶液（PH5.0)中孵育，底物经酶的作用，水解并释放出磷酸；用捕捉剂硝酸铅与磷酸反应，形成微细的磷酸铅沉淀，此时，可在电镜下检出；如再用硫化铵处理时，磷酸铅被置换成硫化铝沉淀，可在光镜下见到。第4页，共111页，编辑于2022年，星期一 脂类显示 脂类物质包括脂肪与类脂。标本可用甲醛固定、冷冻切片、用油红、苏丹、苏内、苏丹黑B、尼罗蓝等脂溶性染料染色；亦可用饿酸固定兼染色，脂类呈黑色

6、。核酸显示法显示DNA的传统方法为Feulgen反应。切片先经稀盐酸处理后，使细胞内DNA水解，打开DNA分子中胶氧核糖核酸和嘌呤碱之间的连接键，使其释放出醛基，再用Schiff试剂处理，形成紫红色反应产物。如用甲基绿-派若宁反应，可同时显示细胞内的DNA和RNA甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝绿色，派若宁与核仁及胞质内的RNA结合呈红色。第5页，共111页，编辑于2022年，星期一3现代意义的细胞与组织化学 包括电镜细胞化学,免疫细胞化学,显微放射自显影,流式细胞术,细胞染色体DNA原位杂交，胞内ca2+测量等。细胞是一个生命体，组织的构成也是由细胞组成，在研究生命规律及探索生命规律的过程中

7、，要应用到许多技术和方法，从而产生了组织和细胞化学等学科。第6页，共111页，编辑于2022年，星期一其发展过程为:1.早期：用放大镜看细胞及组织的形态。（局限于对细胞及组织进行形态描述）2.后期：由于近代物理学、化学及生物等学科的发展，为人们研究细胞内结构及组织切片方法提供了丰富的知识和条件，观察细胞的生命规律及组织切片需建立和应用的手段，到现在已经经历了一个漫长的发展过程，并取得了长足的进步。如放射免疫技术，电镜细胞化学，免疫细胞化学，显微放射自显影等技术已应运而生。第二节组织细胞化学的发展史第二节组织细胞化学的发展史第7页，共111页，编辑于2022年，星期一第二章组织学的研究方法第二章

8、组织学的研究方法第一节概述第二节组织学制片概述 第三节取材和固定第四节固定后的处理第五节染色及染色方法第8页，共111页，编辑于2022年，星期一第一节概述 组织学（组织学（histofogyhistofogy）是应用显微镜研究机体微细结）是应用显微镜研究机体微细结构及其相关功能的科学，是在解剖学的基础上从宏观到微观构及其相关功能的科学，是在解剖学的基础上从宏观到微观发展形成的，故又被称为显微解剖学（发展形成的，故又被称为显微解剖学（microscopic anatomy）。组织学的研究内容，首先要研究组成机体的形态结构与组织学的研究内容，首先要研究组成机体的形态结构与功能单位功能单位细胞；继

9、而 研究在细胞及其产物所组成的基本组织（primary tissueprimary tissue）上皮组织。结缔组织、肌肉组织和神经组织；在此基础上研究各器官系统的微细结构及其有关功能.第9页，共111页，编辑于2022年，星期一组织学是重要的基础课程，只有对机体微细结构的深入了解才可能透彻地阐明其功能；组织学的研究极大地促进了生理学的发展、生物化学的进步也促进了组织学的发展，例如，将生物化学及分子生物学的原理用于组织学而建立起组织化学及分子细胞学，将免疫学的原理用于组织学而建立起免疫组织化学等。从而使人们得知各种细胞与组织的化学组成、分子结构及其基本生命现象，这些知识已成为现代组织学的重要组

10、成部分。第10页，共111页，编辑于2022年，星期一第二节 组织学制片概述1.组织学制片方法组织学制片方法 非切片法直接取物体进行观察，不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法。直接取物体进行观察，不用切片机，不经切片手续而制成切片的方法。包括：包括：a.a.整体封藏法整体封藏法 eg eg 水螅水螅 鸡胚鸡胚 蛙胚蛙胚b.b.涂片法涂片法 针对液体或半液体。针对液体或半液体。Eg Eg 血液血液 骨髓骨髓 腹水腹水c.c.活体标本观察法活体标本观察法 eg eg 蛙口腔黏膜的纤毛运动蛙口腔黏膜的纤毛运动 细胞吞噬细胞吞噬d.d.分离法分离法 egeg分离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞分

11、离三种肌细胞神经纤维脊髓前角神经细胞e.e.铺片法铺片法 egeg肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等肠系膜可观察肥大细胞弹力纤维胶元纤维等f.f.磨片法磨片法 egeg骨组织或牙齿骨组织或牙齿 切片法切片法需依靠切片机将组织切成薄片的方法。需依靠切片机将组织切成薄片的方法。第11页，共111页，编辑于2022年，星期一2.2.组织切片制作流程：组织切片制作流程：杀死、取材与固定、洗涤、脱水、透明、透入、包埋、切片、贴片、染色、封藏。第12页，共111页，编辑于2022年，星期一第三节取材和固定1.取材与固定（组织切片制作的关键步骤）取材：首首先先动动物物组组织织需需从从动动物物体体中中取取

12、出出。方方法法有有多多种种,主主要要是是视视材材料料的的种种类类，实实验动物个体大小及观察的目的而定。验动物个体大小及观察的目的而定。杀死的方法：大的个体杀死的方法：大的个体(实验动物实验动物)用刀，斧头，麻醉等方法用刀，斧头，麻醉等方法.小的个体（实验动物）采用大号剪刀或断头法等。小的个体（实验动物）采用大号剪刀或断头法等。取材注意事项：取材需速度快，取材以后，应立即进行固定。否则细胞会自溶。取材注意事项：取材需速度快，取材以后，应立即进行固定。否则细胞会自溶。鱼鱼杀杀死死后后2 2小小时时再再烹烹调调比比刚刚处处理理完完就就烹烹调调的的味味道道要要更更鲜鲜美美。这这是是细细胞胞自自溶溶导导

13、致致的的结果。结果。第13页，共111页，编辑于2022年，星期一固定 固定的目的：1.防止组织腐败及自溶。2.将所需要的物质原位沉淀、保存，尽量使各种成分保持与原来（活着）的状况相仿。3.沉淀下来以后，会造成组织的折光率的变化。即增加折光性，并使易染色。4.通过固定以后,使组织产生硬化现象,有利于切片的制作。2 2固定的对象固定的对象构成细胞的主要物质是蛋白质,它分散在细胞内,所以固定的对象是蛋白质。第14页，共111页，编辑于2022年，星期一作为固定剂的化学试剂必须具有能凝固或沉淀蛋白质,脂肪等成分,并具有强的渗透力.固定剂必须具备的性质:1)迅速渗入组织杀死原生质(渗透速度要快),即很

14、快能将细胞杀死,固定不会使组织很快产生变化。2)渗透要均匀。(使组织内外尽量保持一致)3)尽量避免出现膨胀和收缩状况。4)尽量避免使组织块变形,卷曲。5)使细胞内蛋白质凝固,沉淀。6)增加折光性,媒染作用和染色能力。7)使组织变硬,适于切片,但又不至于使材料坚硬而松脆。8)固定以后,又能有保存组织的特性(如用福尔马林浸泡)。3组成固定剂的性质和条件 第15页，共111页，编辑于2022年，星期一4.固定剂的作用方式（三种）1)使蛋白质变性.蛋白质变性会成为沉淀物质,其是不可逆的.例：酒精使蛋白质变性不是与蛋白质形成化合物，而是使蛋白质脱水而使之变性。2）固定剂与蛋白质发生化合作用，改变了蛋白质

15、的结构，产生沉淀。3）使蛋白质冻胶化，固定液与蛋白质间起了化学上的结合，改变了分子结构，不产生沉淀，是使蛋白质凝胶化，并不溶与水。第16页，共111页，编辑于2022年，星期一5.固定剂的媒染效果 生活细胞大多不易染色，但经过固定后便易染色，这是由于固定剂与蛋白质相结合，同时也能与染料分子结合，从而使蛋白质着色。6.6.固定剂的穿透率。固定剂的穿透率。穿透率要强，迅速，才能在短时间内使组织内外都得到固定。第17页，共111页，编辑于2022年，星期一7.取材和固定应注意事项1）固定的材料要新鲜。组织会产生自溶。夏天不超过2-4小时。材料取出后应立即固定,有些组织自溶很快。冬天不超过12小时。2

16、）取材的部位要准确。（要清楚所需的材料位于动物体内哪个位置）3）取材工具要锋利，动作需仔细。4）切取的组织块必须小而薄，一般取0.3-0.5mm厚的组织块进行固定。5）清洗。如小肠组织需清洗其内的黏液及食物残渣，才能投入到固定剂内。6）组织块附加标记的方法。组织块取得较多并放在同一容器内，易发生混淆。应加标签以区别之，并注明固定液，材料，日期等。7）固定剂的用量。固定组织，一般所采用的固定液体积为组织块的10-15倍，容器勿过小，材料勿太多。第18页，共111页，编辑于2022年，星期一8.8.常见固定剂的性质及使用常见固定剂的性质及使用-)-)单单纯纯固固定定剂剂 A A 甲甲醛醛（纯甲醛为

17、一种气体）溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林。市面上出甲醛浓度通常为37-40%。甲醛使用时，需采用新鲜的。放置时间较长的甲醛会变成多聚甲醛，为强的还原剂。其不可与氧化剂混合使用。作为固定剂的优点：渗透力强，使组织收缩少。固定均匀，能较好的固定脂肪。神经及髓鞘，且能固定高尔基体，线粒体。缺点：不能固定白蛋白和核蛋白。B 乙醇（为无色透明的液体)其可与水混合。优点:可以沉淀白蛋白,球蛋白,核蛋白.穿透力强,渗透力较弱。缺点:不宜作低温固定.酒精浓度超过50%可溶解组织内的脂肪.类脂体,血色素等。C C 醋酸醋酸（具刺激味的无色液体)固定组织通常用5%的HAC。PH2-6.防止细胞自溶。优点:其能沉

18、淀核蛋白,是种好的染色质固定剂.穿透速度快.固定时间较短,通常1小时即可。缺点:其不能沉淀白蛋白、球蛋白使组织膨胀,高浓度HAC会破坏线粒体和高尔基。第19页，共111页，编辑于2022年，星期一 D 苦味酸(常见的一种酸)为一种强酸,黄色结晶.其在干燥空气中激烈晃动,会发生爆炸,苦味酸的运输以溶解在水中的饱和苦味酸,浓度为1%。作为固定液的优点:能沉淀所有的蛋白质,穿透力强。缺点:使组织收缩。E E 重重铬铬酸酸钾钾(橙红色的结晶,强氧化剂,不可与还原剂(酒精)等混用.重铬酸钾溶液中加醋酸后,产生铬酸,才能使蛋白质产生沉淀。优点:穿透力较强。缺点:使组织产生一点膨胀。F.锇酸(四养化锇)为黄

19、色的结晶,为强的氧化剂。优点:其为脂肪及类脂体的唯一的固定剂,能将线粒体及高尔基体固定成为黑色.穿透速度慢,可保持组织柔软。缺点:较难固定组织,毒性高,易损伤眼睛及黏膜,价格昂贵。G G 氯化汞氯化汞:通称升汞,剧毒,呈白色粉末状,以针状结晶为最纯,能沉淀一切蛋白质(包括核蛋白)。优点:其对蛋白质有较强的沉淀作用,能充分固定细胞质和细胞核。第20页，共111页，编辑于2022年，星期一二二)混合固定液混合固定液.Bouin.Bouin液液 苦味酸饱和水溶液甲醛冰醋酸苦味酸饱和水溶液甲醛冰醋酸该固定液渗透力强该固定液渗透力强,使组织收缩少使组织收缩少.固定时间固定时间12-2412-24小时小时

20、.Carnoy.Carnoy液无水乙醇氯仿冰醋酸液无水乙醇氯仿冰醋酸对组织穿透速度快对组织穿透速度快,多用于糖原多用于糖原,脱氧核糖核酸固定脱氧核糖核酸固定.Zenker.Zenker液重铬酸钾升汞双蒸水冰醋酸液重铬酸钾升汞双蒸水冰醋酸采用该液采用该液,须脱汞处理须脱汞处理.Helly.Helly液液 重铬酸钾升汞双蒸水甲醛重铬酸钾升汞双蒸水甲醛第21页，共111页，编辑于2022年，星期一第四节 固定后的处理1.洗涤洗涤的目的 组组织织在在固固定定后后一一定定要要把把渗渗入入组组织织里里面面的的固固定定液液洗洗去去，然然后后进进行行下下一一个个过过程程，为为防防止止组组织织中中留留有有较较多

21、多的的固固定定剂剂影影响响脱脱水水剂剂，甚甚至至可可在在组组织织中中发发生生沉沉淀淀或或结结晶晶而而影影响响观观察察，特特别别是是对对陈陈旧旧性性标标本本更更应应注注意意流流水水冲冲洗洗，尽尽可可能能减减少少组组织织中中的的酸酸性性程程度度和和甲甲醛醛色色素素。对对于于混混合合性性固固定定液液，更更应应及及时时洗洗涤涤，有有利利于于脱脱水水，切片和染色。切片和染色。第22页，共111页，编辑于2022年，星期一洗涤的方法1 1固定剂以水配置者固定剂以水配置者 用流水冲洗，可使组织中固定液随时溢出和随时洗去。用流水冲洗，可使组织中固定液随时溢出和随时洗去。大的动物组织冲洗时间为大的动物组织冲洗时

22、间为2424小时左右，小动物组织冲洗时间为小时左右，小动物组织冲洗时间为2-102-10小时。小时。冲冲洗洗的的时时间间基基本本根根据据固固定定的的时时间间而而定定,新新鲜鲜的的标标本本固固定定时时间间短短,需需及及时时脱脱水水者者,冲冲洗洗时间短时间短.固定时间短。固定时间短。2 2 固定剂含乙醇者固定剂含乙醇者 一般不要求冲洗，如需冲洗必须采用与固定剂溶度相近的乙醇冲洗。一般不要求冲洗，如需冲洗必须采用与固定剂溶度相近的乙醇冲洗。3 3 特殊固定液洗涤法特殊固定液洗涤法 1 1）重铬酸钾）重铬酸钾 流水冲洗流水冲洗12-2412-24小时，或用亚硫酸，或用小时，或用亚硫酸，或用1%1%含氯

23、水溶液进行洗涤。含氯水溶液进行洗涤。2 2）锇锇酸酸 流水冲洗流水冲洗12-2412-24小时，务必冲干净。小时，务必冲干净。3 3）苦味酸）苦味酸 用用50%50%或或70%70%乙醇浸泡。尽量洗去黄色。乙醇浸泡。尽量洗去黄色。4 4）氯氯化化汞汞 用用0.5%0.5%碘碘酒酒溶溶液液反反复复加加入入到到70%70%乙乙醇醇中中，直直至至黄黄色色不不再再褪褪去去为为止止.再再用硫代硫酸钠或用硫代硫酸钠或70%70%乙醇洗去碘。乙醇洗去碘。第23页，共111页，编辑于2022年，星期一2.常用脱水剂 乙醇 为为常常用用的的脱脱水水剂剂。脱脱水水能能力力强强，并并能能使使组组织织硬硬化化。一一般

24、般的的脱脱水水顺顺序序是是 70%70%、80%80%、90%90%、95%I95%I、95%II95%II、无无水水乙乙醇醇I I、无无水水乙乙醇醇II II、无无水水乙乙醇醇IIIIII。应注意的是脱水必须在有盖的瓶子内进行。应注意的是脱水必须在有盖的瓶子内进行。丙酮 沸沸点点为为56 56，脱脱水水作作用用比比乙乙醇醇强强，但但对对组组织织块块的的收收缩缩较较大大。脱脱水水时间通常为时间通常为1-31-3小时。小时。正丁醇 为为无无色色液液体体，沸沸点点100-118100-118，微微溶溶于于水水。一一般般使使用用方方法法为为：组组织织块块经经固固定定及及冲冲洗洗后后先先入入50%-7

25、0%-80%50%-70%-80%乙乙醇醇中中脱脱水水，然然后后转转入入正正丁丁醇醇12-2412-24小小时时浸浸蜡。蜡。叔丁醇 是异丁醇的一种，无毒，熔点为是异丁醇的一种，无毒，熔点为2525。电镜上常用的中间脱水剂。电镜上常用的中间脱水剂。第24页，共111页，编辑于2022年，星期一3.透明 透明的目的 在在制制片片过过程程中中有有两两次次透透明明，第第一一次次是是脱脱水水以以后后的的透透明明；第第二二次次透透明明是是染染色色后后的的切切片片透透明明。组组织织块块透透明明的的目目的的是是便便于于浸浸蜡蜡包包埋埋，切切片片透透明明目目的的是是有有利利于于光光线线的的透透过过，便便于于显显

26、微镜的观察。微镜的观察。透明剂的种类 1 1 二甲苯二甲苯 2 2 甲苯甲苯 3 3 苯苯 4 4 香柏油香柏油第25页，共111页，编辑于2022年，星期一4.浸蜡与包埋5.包埋6.切片7.贴片8.染色第26页，共111页，编辑于2022年，星期一第五节 染色及染色方法1.天然染料 苏木精苏木精 本身不作为染料，其氧化产物苏木红才作为染料。本身不作为染料，其氧化产物苏木红才作为染料。氧化的方式：氧化的方式：1 1）自然氧化作用自然氧化作用 2 2）化学氧化作用化学氧化作用 卡红卡红 靛兰 地衣红 巴西木素第27页，共111页，编辑于2022年，星期一2.人工合成染料 生色团与助色团生色团与助

27、色团 酸性、碱性与中性染料酸性、碱性与中性染料 1)酸性染料（阴离子染料）生色团位于其分子的阴离子处。2)碱性染料（阳离子染料）生色团位于其分子的阳离子处。第28页，共111页，编辑于2022年，星期一3.异染现象 染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。4.荧光染料 是指需要经过波长很短（低于400nm）的紫外线照射激发以后而发出荧光的一类特殊染料。第29页，共111页，编辑于2022年，星期一 第三章第三章 光镜标本制作光镜标本制作组织学的研究方法很多，并随着科学技术的发展，又不断创建新技组织学的研究方法很多，并随着科

28、学技术的发展，又不断创建新技术，在应用中要根据研究的目的和内容，选用相应的方法才能获得术，在应用中要根据研究的目的和内容，选用相应的方法才能获得预期的效果。这里仅就最常用、最基本的一些方法做简要介绍。预期的效果。这里仅就最常用、最基本的一些方法做简要介绍。第一节第一节涂片、铺片、磨片标本的制备涂片、铺片、磨片标本的制备 第二节第二节切片标本的制备切片标本的制备 第30页，共111页，编辑于2022年，星期一第一节涂片、铺片、磨片标本的制备 1.涂片标本的制备涂片（涂片（smearsmear）法是常用的一种方法，如血液等可直接涂于载玻片上制成涂片标）法是常用的一种方法，如血液等可直接涂于载玻片上

29、制成涂片标本，干燥后进行固定、染色及封固。本，干燥后进行固定、染色及封固。2.铺片标本的制备（stretched preparation）用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织，可将其铺于载玻片上，撕开、用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织，可将其铺于载玻片上，撕开、展平制成铺片标本，待干燥后进行固定染色。展平制成铺片标本，待干燥后进行固定染色。第31页，共111页，编辑于2022年，星期一3.磨片标本的制备（ground section）用于坚硬组织的标本制作，如骨和牙等坚硬组织除用酸（如稀硝酸）脱钙后再按常规制成切片标本外，也可直接将其磨成薄的磨片标本进行观察。第

30、32页，共111页，编辑于2022年，星期一第二节切片标本的制备观察机体各部的微细结构时，首先要制成薄片，就是切片法，其中以石蜡切片观察机体各部的微细结构时，首先要制成薄片，就是切片法，其中以石蜡切片（Paraffin sectionParaffin section）最为常见。）最为常见。第33页，共111页，编辑于2022年，星期一其制备程序大致如下:取材与固定：取材要尽量新鲜动物材料。取得新鲜材料后，切成适当的小块1.0立方厘米大小）立即投入固定剂（fixative）中进行固定，使组织中蛋白质迅速凝固，防止组织自溶或腐败，以保持生活状态下的结构。常用的固定剂有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、饿酸

31、等。脱水（dehydtation）、透明（clearing）与包埋（embedding）:把固定好的材料用乙醇将组织内的水分脱掉，经二甲苯透明后，再浸入已融化的石蜡中进行浸透、包埋。切片（section）与染色（staining）：用切片机（microtome）切成510m的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行染色，最常用的染色法是苏木精（hematoxylin,haematoxylin)和伊红（eosin）染色简称HE染色。配制后的苏木精染液呈碱性，可使细胞核内的染色质及细胞质内的核糖体等染成蓝紫色，称嗜碱性（basophilia)；伊红是酸性染料，可使多数细胞的细胞质染成粉红色，称嗜酸性（aci

32、dophilia）；耐碱性和酸性染液亲合力都不强的，称为中性（neutroPhilia）；封固（mounting）：切片经脱水、透明后，于切片上滴加中性树胶和盖片进行封固后，贴标签备用。第34页，共111页，编辑于2022年，星期一除HE染色外，还有多种染色方法。有的能特异性的显示细胞内某些结构，如使用雷锁辛品红（resorcin-fuchsin)染液显示组织内的弹性纤维；有的细胞经重铬酸盐处理后，呈棕褐色，称嗜铬性（chromaffinity）；有的组织成分经硝酸银处理时，可使硝酸银还原，形成银微粒附着在组织中呈棕黑色，该特性称为亲银性（argentaffin）；有的组织结构成分，本身不能使

33、硝酸银还原，需加还原剂方能使硝酸银还原，形成棕褐色很微粒附着在组织结构上，这种性质称为嗜银性（argyrophilia）；如肥大细胞中的颗粒经甲苯胺蓝（tofuidine blue）等碱性染料染色后,呈紫红色，这种现象称异染性(metachromasia），其原理可能是染料在溶液中以单体存在时呈蓝色，当它与颗粒中具有大量阴离子的多糖成分耦合后，聚合成多聚体而呈紫红色。第35页，共111页，编辑于2022年，星期一除石蜡切片外，在制作较大结构（如眼球、睾丸等）的切片时，常用火棉胶包埋法；骨和牙等坚硬的组织，可用弱酸（稀硝酸）脱钙后，用石蜡或火棉胶切片（celloidin section）法制成切

34、片标本；还有，为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，可选用冷冻切片（frozen section），它是将组织先在低温下快速冻结，经直接切片后进行染色，或将组织块置入液氮（-196）内快速冷冻，用恒冷箱切片（cryostat section）后进行染色。第36页，共111页，编辑于2022年，星期一 第四章第四章 光学显微技术光学显微技术 第一节 光 镜 技 术 第二节 电子显微镜技术第37页，共111页，编辑于2022年，星期一第一节 光 镜 技 术几种特殊显微镜术:相差显微镜干涉微分相差显微镜荧光显微镜暗视野显微镜共焦激光扫描显微镜第38页，共111页，编辑于2022年，星

35、期一相差显微镜 是用于观察生活细胞或未经染色细胞的形态结构。生活细胞无色透明，是用于观察生活细胞或未经染色细胞的形态结构。生活细胞无色透明，细胞内各种结构间的反差很小，在一般光学显微镜下难以观察到细胞细胞内各种结构间的反差很小，在一般光学显微镜下难以观察到细胞的轮廓及内部结构，必须使用相差显微镜。的轮廓及内部结构，必须使用相差显微镜。相差显微镜的结构特点是：相差显微镜的结构特点是：装有不同大小环状光阑的聚光器。装有不同大小环状光阑的聚光器。物镜内装有位相板。物镜内装有位相板。中心望远镜装置。相差显微镜的基本原理是通过上述装置。把透过标中心望远镜装置。相差显微镜的基本原理是通过上述装置。把透过标

36、本的可见光的相位差变成振幅本的可见光的相位差变成振幅 差，从而提高了标本内各种结构之间的差，从而提高了标本内各种结构之间的对比度，使标本中的结构清晰可辨。对比度，使标本中的结构清晰可辨。第39页，共111页，编辑于2022年，星期一若观察生长在培养瓶中的生活细胞，则需应用倒置相差显微镜（inverted phase con-trast microsope）。它与相差显微镜基本相同，它的特点是物镜安装在载物台的下方，光源及长焦距聚光器安装在载物台的上方；可以对体外培养细胞进行长时间观察、拍照、摄电影及录像等以记录生活细胞的行为。第40页，共111页，编辑于2022年，星期一干涉微分相差显微镜 基

37、本原理与相差显微镜非常相似，但它有一装有分光器的聚光器，利用分基本原理与相差显微镜非常相似，但它有一装有分光器的聚光器，利用分光器将光束分为两组，一组光束通过被检物，另一束则通过周围介质，光器将光束分为两组，一组光束通过被检物，另一束则通过周围介质，旋转检偏器，光的干涉形成光程差，可随旋转，两光束形成不同的角度，旋转检偏器，光的干涉形成光程差，可随旋转，两光束形成不同的角度，于是被检物呈现出不同颜色，致使生活细胞如同染上颜色一样，故又称于是被检物呈现出不同颜色，致使生活细胞如同染上颜色一样，故又称为光染色。它与相差显微镜相比，除有鲜艳的颜色外，在细胞周围不出为光染色。它与相差显微镜相比，除有鲜

38、艳的颜色外，在细胞周围不出现明亮的晕环。现明亮的晕环。第41页，共111页，编辑于2022年，星期一荧光显微镜 是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。它是装有、能产生紫外线（短波是用以观察细胞及组织内荧光物质的分布。它是装有、能产生紫外线（短波长）的光源及系列滤片装置的显微镜。由于紫外线的照射，标本中的荧光物长）的光源及系列滤片装置的显微镜。由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光，如维生素质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光，如维生素A A呈绿色呈绿色荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色金黄色荧光。但是荧光、心肌细胞内脂褐素呈棕黄色金黄色荧光。但

39、是,细胞内的某些成细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，始可呈现一定颜色的荧光；分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，始可呈现一定颜色的荧光；如应吖啶橙（荧光素）处理细胞后，细胞核内的如应吖啶橙（荧光素）处理细胞后，细胞核内的DNADNA呈绿黄绿色荧光，呈绿黄绿色荧光，细胞质及核仁内的细胞质及核仁内的RNARNA呈桔黄桔红色荧光。利用荧光染色法及荧光显呈桔黄桔红色荧光。利用荧光染色法及荧光显微镜可以观察组织、细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨微镜可以观察组织、细胞的结构、细胞内某些成分含量的变化，并探讨细胞的功能状态。或用荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞化学细

40、胞的功能状态。或用荧光素标记免疫球蛋白，进行免疫荧光细胞化学研究。研究。第42页，共111页，编辑于2022年，星期一暗视野显微镜 特特点点是是该该显显微微镜镜具具有有暗暗视视野野聚聚光光器器，使使光光线线不不直直接接进进人人物物镜镜，故故呈呈暗暗视视野野。该该显显微微镜镜适适用用于于观观察察细细胞胞内内微微小小颗颗粒粒，例例如如线线粒粒体体、细细菌菌运运动动等等。人人眼眼的的分分辨辨力力为为200um,200um,普普通通光光镜镜为为0.2um0.2um，而而暗暗视视野野显显微镜的分辨力为其微镜的分辨力为其5050倍，为倍，为004um.004um.第43页，共111页，编辑于2022年，星

41、期一共焦激光扫描显微镜 是是8080年年代代初初研研制制成成功功的的一一种种高高光光敏敏度度、高高分分辨辨率率的的新新型型仪仪器器。它它的的主主要要特特点点是是：以以激激光光作作为为光光源源。采采用用共共焦焦成成像像系系统统 扫扫描描、显显示示及及记记录录系系统统。激激光光具具有有发发散散角角小小、方方向向性性好好的的优优点点，光光束束通通过过聚聚焦焦后后落落在在样样品品（如如细细胞胞等等）的的不不同同深深度度；在在不不同同方方向向、不不同同深深度度的的平平面面上上进进行行聚聚焦焦扫扫描描，从从而而得得到到一一系系列列不不同同层层次次的的清清晰晰图图像像。平平面面间间隔隔最最小小约约 6006

42、00800nm800nm；利利用用微微机机图图像像合合成成系系统统可可重重建建细细胞胞的的三三维维图图像像，可可对对细细胞胞进进行行体体视视学学的的定定量量分分析析研研究究；CLSMCLSM可可以以更更精精确确地地检检测测、识识别别，组组织织或或细细胞胞内内的的微微细细结结构构及及其其变变化化。由由此此，CLSMCLSM又有细胞又有细胞CTCT之称。之称。第44页，共111页，编辑于2022年，星期一第二节 电子显微镜技术 目前，电子显微镜技术（目前，电子显微镜技术（electron microscopy)electron microscopy)已成为研已成为研究机体微细结构的重要手段。常用的

43、有透射电镜究机体微细结构的重要手段。常用的有透射电镜（transmission electron microscopetransmission electron microscope，TEMTEM）和扫描电）和扫描电子显微镜（子显微镜（scanning electron microscope,SEMscanning electron microscope,SEM）。与光）。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。第45页，共111页，编辑于2022

44、年，星期一成像原理 透射电镜技术 扫描电镜术 冷冻蚀刻复型术 冷冻割断术第46页，共111页，编辑于2022年，星期一透射电镜技术 透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.10.10.2nm0.2nm，放大倍数为几万几十万倍。由于电子易散射或被，放大倍数为几万几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为5050100nm100

45、nm）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。要）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。要在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小(1(1立方毫米以内），立方毫米以内），常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋,用特制的超薄切片用特制的超薄切片机（机（ultramicrotomeultramicrotome）切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进）切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。行电子染色。第47页，共111页，编辑于2022年，星期一电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，

46、如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高（electron dense）。反之，则称为电子密度低（electron lucent）。第48页，共111页，编辑于2022年，星期一扫描电镜术 扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。扫描电镜

47、样品用戊二醛和饿酸等固定，经脱水和临界点干燥扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定，经脱水和临界点干燥后后,再于样品表面喷镀薄层金膜，以增加二波电子数。扫描电镜能观再于样品表面喷镀薄层金膜，以增加二波电子数。扫描电镜能观察较大的组织表面结构，由于它的景深长，察较大的组织表面结构，由于它的景深长，1mm1mm左右的凹凸不平面左右的凹凸不平面能清所成像，故放样品图像富有立体感。能清所成像，故放样品图像富有立体感。第49页，共111页，编辑于2022年，星期一冷冻蚀刻复型术 冷冻蚀刻复型（冷冻蚀刻复型（freeze etch replica freeze etch replica）是电镜样品的一种制备技术

48、，以显示细）是电镜样品的一种制备技术，以显示细胞、组织微细结构的立体构像。胞、组织微细结构的立体构像。其样品制备步骤如下：其样品制备步骤如下：冷冻：冷冻：先把组织浸入含有先把组织浸入含有20203030的甘油生理盐水的冷冻保护剂中，以防止冰晶形成和的甘油生理盐水的冷冻保护剂中，以防止冰晶形成和提高冷冻速度，然后把组织放入液氮（提高冷冻速度，然后把组织放入液氮（-196)-196)内快速冻结；内快速冻结；断裂在低温真空内，把冻结的组织用钢刀劈开，断裂面常为组织、细胞的薄断裂在低温真空内，把冻结的组织用钢刀劈开，断裂面常为组织、细胞的薄弱部位，如膜的双层类脂质分子的疏水极之间余下部分的表面要观察的

49、部位冷弱部位，如膜的双层类脂质分子的疏水极之间余下部分的表面要观察的部位冷冻蚀刻冻蚀刻 蚀刻：蚀刻：在真空内将温度回升到在真空内将温度回升到-100-100，使断裂面的冰，使断裂面的冰升华，形成凹凸不平的形态；升华，形成凹凸不平的形态；复型复型:在断裂面以在断裂面以4545角喷镀一层铂膜，以增加图像的反差和立体感，再喷镀一层碳膜角喷镀一层铂膜，以增加图像的反差和立体感，再喷镀一层碳膜以加固铂膜。然后用次氯酸钠等腐蚀液除去组织，捞取复型膜在透射电镜下观察。以加固铂膜。然后用次氯酸钠等腐蚀液除去组织，捞取复型膜在透射电镜下观察。第50页，共111页，编辑于2022年，星期一冷冻蚀刻复型技术是研究细

50、胞膜相结构的重要手段。细胞膜的双层类脂质层被劈分开后，其外层的内表面称胞质外面或E面（extracellular face，E-face）；其内层的外表面称胞质面或P面（plasllllc face，P-face）；在P面常可见许多直径69nm的膜内粒子，而E面则较少。一般认为腹内粒子是细胞膜和细胞内膜相结构中的镶嵌蛋白质粒子的图像，膜内粒子的数量与分布随膜的功能状态而变化。因此，可应用冷冻蚀刻复型求研究膜结构与功能的关系。第51页，共111页，编辑于2022年，星期一冷冻割断术（freeze cracking)将固定组织经过处理后。置于特制的冷冻台上，浸于二甲基亚砜中，低温下将固定组织经过处