细菌药敏试验及其耐药表型检测幻灯片.ppt

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1、细菌药敏试验及其耐药表型检测第1页，共54页，编辑于2022年，星期一抗菌药物敏感试验测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST）。第2页，共54页，编辑于2022年，星期一药敏试验的意义预测抗菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应用；发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。第3页，共54页，编辑于2022年，星期一药敏试验MIC：在

2、与微生物生长速率有关的特定时间间隔内，通常是1824小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。第4页，共54页，编辑于2022年，星期一敏感性分类(CLSI的定义)敏感（Susceptible）用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。耐药（Resistance）用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度第5页，共54页，编辑于2022年，星期一敏感性分类（2）中介(Intermediate)MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗反应率低于敏感株药物生理浓集部位有效(尿-FQ)加大用药剂量可能有效第6页，共54页，编辑于2022年，星期

3、一药敏试验的方法学半定量纸片扩散法 (抑菌圈直径)MIC法：稀释法(肉汤、琼脂)自动化仪法抗生素连续梯度法(Etest)流式细胞仪第7页，共54页，编辑于2022年，星期一 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。纸片扩散法（Kirby-Bauer法）第8页，共54页，编辑于2022年，星期一纸片扩散法1.水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.27.4

4、，做成琼脂厚度4mm，直径90mm的平板；2.挑取孵育16 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准。第9页，共54页，编辑于2022年，星期一纸片扩散法3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；4.然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度；5.最后沿平板内缘涂抹1周；6.平板在室温下干燥35min，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘大于15mm。第10页，共54页，编辑于2022年，星期一纸片扩散法7.35孵育1624小时量取抑菌圈直径；8.根据抑菌环的直径，按照CLS

5、I标准判读，报告敏感、中介、耐药。第11页，共54页，编辑于2022年，星期一纸片扩散法影响因素MIC接种菌量细菌生长率抗生素含量、扩散性平皿厚度温度，预孵育时间12第12页，共54页，编辑于2022年，星期一纸片扩散法标准化CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)每年修订更改包括质控新药的判定标准特殊耐药性的检测13第13页，共54页，编辑于2022年，星期一CLSI的法规规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准、质控；规定常规测试报告的抗生素；不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。14第14

6、页，共54页，编辑于2022年，星期一常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(1)肠杆菌科 绿脓和非肠杆菌科一 级 氨苄西林 头孢他啶，庆大霉素 头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林二级 阿米卡星 阿米卡星 氨苄西林/舒巴坦 头孢吡肟，头孢哌酮 阿莫西林/克拉维酸氨曲南 头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南 头孢噻肟，头孢曲松 替卡西林/克拉维酸 环丙沙星，亚胺培南 妥布霉素，复方磺胺 替卡西林，哌拉西林 三级 氨曲南，头孢他啶头孢曲松 卡那霉素，奈替米星 氯霉素，奈替米星 妥布霉素 四环素，氯霉素 15第15页，共54页，编辑于2022年，星期一常规测试并报告的药物分组常规测试并报告

7、的药物分组(2)葡萄球菌肠球菌一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林二级 红霉素类万古霉素 克林霉素，万古霉素三级 氯霉素庆大霉素16第16页，共54页，编辑于2022年，星期一常规测试并报告的药物分组常规测试并报告的药物分组(3)流感嗜血杆菌肺炎链球菌一级 氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素 复方磺胺 复方磺胺二级 头孢呋肟，头孢噻肟氧氟沙星，四环素 头孢他啶，氯霉素 万古霉素三级 阿奇霉素，头孢克罗氯霉素，利福平 环丙沙星，亚胺培南利福平，四环素17第17页，共54页，编辑于2022年，星期一预报用药(一)测试药菌名推测其他药物的敏感性 苯唑西林葡萄球菌所有-内酰胺类 四环素所有（除葡多西环

8、素，米诺环素 萄球菌和不 动杆菌红霉素G球菌罗红霉素，克拉霉素，阿奇霉素克林霉素所有林可霉素18第18页，共54页，编辑于2022年，星期一预报用药(二)测试药菌名推测其他药物的敏感性氨苄西林肠球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨苄西林，美洛西林 替卡西林头孢噻吩肠杆菌科头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类万古霉素所有替考拉宁2023/4/1419第19页，共54页，编辑于2022年，星期一以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察其最低抑菌浓度。稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基者为肉汤稀释法。药敏试验-稀释法第

9、20页，共54页，编辑于2022年，星期一E test 法nE试条是一条5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度；n抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围；n将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。第21页，共54页，编辑于2022年，星期一2023/4/14wanghui-ART22E test 法 细菌生长区E test 塑料条椭圆形细菌生长抑制区256128 8016判读抑菌浓度（MIC ug/m

10、l)第22页，共54页，编辑于2022年，星期一E test 法菌液制备及接种均同纸片扩散法。90mm平板上可放E试验试条1 2条，140mm平板最多可放6条。孵育温度及时间同纸片扩散法。第23页，共54页，编辑于2022年，星期一E test 法优点连续浓度梯度，与琼脂稀释法相关性好影响因素少，稳定性高操作简单，省时缺点：昂贵用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，分枝杆菌2023/4/1424第24页，共54页，编辑于2022年，星期一细菌耐药机制 细菌耐药机制主要有四种：产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶的改

11、变等；细菌膜的通透性下降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋白丢失；细菌主动外排系统的过度表达。在上述耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。第25页，共54页，编辑于2022年，星期一-内酰胺酶 内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中；检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。第26页，共54页，编辑于2022年，星期一 葡萄球菌属 青霉素 方法敏感中介耐药MIC0.12 g/ml-0.25 g/ml纸片扩散法29 mm-28 mmCL

12、SI M100-S20.Table 2C.CLSI M100-S20.Table 2C.第27页，共54页，编辑于2022年，星期一诱导-内酰胺酶试验苯唑西林苯唑西林(诱导剂诱导剂)-接种纯菌落于琼脂上接种纯菌落于琼脂上接种纯菌落于琼脂上接种纯菌落于琼脂上 (例如，例如，例如，例如，BAP,MHA)BAP,MHA)；-贴贴贴贴-内酰胺类纸片内酰胺类纸片内酰胺类纸片内酰胺类纸片 (例如例如例如例如,苯唑西林苯唑西林苯唑西林苯唑西林,头孢头孢头孢头孢西丁西丁西丁西丁)；-孵育过夜；孵育过夜；孵育过夜；孵育过夜；-测试抑菌圈周围的细菌；测试抑菌圈周围的细菌；测试抑菌圈周围的细菌；测试抑菌圈周围的细菌

13、；-如果如果如果如果-内酰胺酶阳性内酰胺酶阳性内酰胺酶阳性内酰胺酶阳性,报告青霉素报告青霉素报告青霉素报告青霉素R R。PosPosNegNeg第28页，共54页，编辑于2022年，星期一超广谱-内酰胺酶（ESBLs）ESBLs是指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类氨曲南的一类酶；ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等内酰胺酶抑制剂所抑制；ESBLs主要见于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，此外也见于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷菌属等其他肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌。第29页，共54页，编辑于2022年，星期一超广谱-内酰胺酶

14、（ESBLs）纸片法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL（筛选阳性）：头孢泊肟17mm头孢他啶22mm头孢噻肟27mm头孢曲松25mm氨曲南 27mm第30页，共54页，编辑于2022年，星期一超广谱-内酰胺酶（ESBLs）纸片法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任一复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差5mm时，即可判断该菌产ESBL。第31页，共54页，编辑于2022年，星期一超广谱-内酰胺酶（ESBLs）稀释法，出现以下一种情况即可怀疑该菌株产生ESBL：头孢他啶或头孢噻肟或头孢曲松或氨曲南MIC2g/mL或头孢泊肟MIC8g/mL

15、 第32页，共54页，编辑于2022年，星期一超广谱-内酰胺酶（ESBLs）稀释法（表型确认试验）头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸、头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸。任何一组酶抑制剂复方制剂的MIC值比相应单药的MIC降低3个稀释度者即可判定该菌为产ESBL菌株。第33页，共54页，编辑于2022年，星期一AmpC酶的特征AmpC酶是在革兰阴性菌中发现的由染色体或质粒介导的水解头孢菌素的型内酰胺酶，可分为诱导酶和非诱导酶。与ESBLs不同的是，AmpC酶对三代头孢菌素耐药但对四代头孢菌素敏感且不被酶抑制剂克拉维酸所抑制，但其酶活性可被氯唑西林和硼酸抑制。第34页，共54页，编辑于2022年，星期一Am

16、pC酶的检测方法头孢西丁三维试验是检测AmpC酶的经典方法；除此之外，还有以硼酸化合物为抑制剂检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的AmpC酶、AmpC Disk、头孢西丁琼脂基础法等。第35页，共54页，编辑于2022年，星期一碳青霉烯酶碳青霉烯酶可以定义为具有水解碳青霉烯类抗生素活性的-内酰胺酶，主要分布于-内酰胺酶A、B、D类中。根据水解机制中作用位点的不同可以将碳青霉烯酶分为两大类：一类称为金属碳青霉烯酶，这类酶以金属锌离子为活性作用位点，可以被EDTA抑制，属于B类-内酰胺酶；另一类以丝氨酸（Ser）为酶的活性作用位点，可以被酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制，属于A、D类-内酰胺酶。第36页

17、，共54页，编辑于2022年，星期一碳青霉烯酶A类酶B类酶D类酶染色体编码：SME NMC IMI质粒编码：KPC GES质粒编码 OXA-23 OXA-24 OXA-51 OXA-58 OXA-55 OXA-48 OXA-50 OXA-60 OXA-62金属酶，位于GMEs上，包括VIM，IMP，GIM，SPM，SIM等可以被酶抑制剂抑制可以被EDTA抑制第37页，共54页，编辑于2022年，星期一碳青霉烯酶表型检测方法-改良改良hodge试验试验ATCC25922，0.5麦氏，1:10稀释涂MH平板平皿中心贴10g 厄他培南或亚胺培南纸片 10l环挑取3 5个菌落从平板中心纸片边缘向平板边

18、缘划线 被测菌株与大肠埃希菌ATCC25922 抑菌环交汇处大肠埃希菌生长增强，即产碳青霉烯酶。第38页，共54页，编辑于2022年，星期一改良改良hodge试验的结果判读试验的结果判读第39页，共54页，编辑于2022年，星期一金属酶表型检测方法：EDTA协同试验用0.5麦氏单位的待测菌悬液涂布M H 平板。贴IMP(10g)纸片距其1cm 处贴EDTA纸片（0.5mol/L 4l）。35 过夜培养。亚胺培南抑菌圈在靠近加EDTA纸片侧明显扩大者为产金属酶菌株。亚胺培南EDTA10mm第40页，共54页，编辑于2022年，星期一 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）携带SCCmec基因盒。S

19、CCmec基因盒中的MecA基因编码修饰的青霉素结合蛋白PBP2a，这种蛋白对甲氧西林和其他的-内酰胺类抗生素亲和力下降，从而导致对这些抗生素的耐药。耐甲氧西林葡萄球菌第41页，共54页，编辑于2022年，星期一耐甲氧西林葡萄球菌的检测MRSA的检测方法有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法、乳胶凝胶试验检测PBP2a、mecA基因测定及MRSA显色培养基。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。对于金黄色葡萄球菌，MRSA的检测可以使用苯唑西林纸片，但对于凝固酶阴性葡萄球菌则不能使用苯唑西林纸片。第42页，共54页，编辑于2022年，星期一凝固酶阴性葡

20、萄球菌中苯唑西林MIC结果的报告策略*苯唑西林苯唑西林苯唑西林苯唑西林 MIC(MIC(g/ml)g/ml)进行进行进行进行 mecmecA A 或或或或 PBP2a PBP2a 或或或或头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散头孢西丁纸片扩散 0.250.25 4.04.00.5-2.00.5-2.0报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报报告苯告苯告苯告苯唑唑西林耐西林耐西林耐西林耐药药阴性阴性阴性阴性阳性阳性阳性阳性报告苯唑西林敏感报告苯唑西林敏感报告苯唑西林耐药报告苯唑西林耐药*检测无菌部位感染的检测无菌部位感染的 非表皮葡萄球菌菌株非表皮葡萄球菌菌株

21、第43页，共54页，编辑于2022年，星期一克林霉素诱导耐药试验 第44页，共54页，编辑于2022年，星期一克林霉素诱导耐药葡萄球菌红霉素*耐药的金葡菌或凝固酶阴性葡萄球菌可对克林霉素结构性或诱导性耐药或仅对红霉素耐药。*或其他大环内酯类第45页，共54页，编辑于2022年，星期一机制机制机制机制耐药基因耐药基因耐药基因耐药基因红霉素红霉素红霉素红霉素克林霉素克林霉素克林霉素克林霉素核糖体修饰核糖体修饰核糖体修饰核糖体修饰-药物不能结药物不能结药物不能结药物不能结合于靶位合于靶位合于靶位合于靶位ermermR RS*S*R RR R结构性结构性结构性结构性泵泵泵泵-药物被泵出药物被泵出药物被

22、泵出药物被泵出msrmsrA AR RS Sermerm=erythromycin ribosome methylase=erythromycin ribosome methylasemsrAmsrA=macrolide streptogramin resistance=macrolide streptogramin resistance*需要诱导来显示耐药性需要诱导来显示耐药性 红霉素/克林霉素耐药葡萄球菌耐药机制第46页，共54页，编辑于2022年，星期一诱导性克林霉素耐药（诱导性克林霉素耐药（erm介导）介导）葡萄球菌-“D试验”患者不会对克林霉素有反应-报告克林霉素耐药无克林霉素诱导（

23、无克林霉素诱导（msrA介导）介导）真的克林霉素敏感真的克林霉素敏感-报告克林霉素敏感报告克林霉素敏感“D”阳性阳性阴性阴性15 15 26 mm 26 mm第47页，共54页，编辑于2022年，星期一葡萄球菌诱导性克林霉素耐药的MIC检测方法4.04.0 g/ml g/ml 红霉素红霉素 0.50.5g/ml g/ml 克林霉素克林霉素No growthNo growth=无诱导性克林霉素耐无诱导性克林霉素耐药药生长生长=诱导性克林霉素耐药诱导性克林霉素耐药第48页，共54页，编辑于2022年，星期一对于红霉素耐药，克林霉素敏感的葡萄球菌，需检测诱导性克林霉素耐药注意试验适用于金葡菌和凝固酶

24、阴性葡萄球菌(苯唑西林敏感和耐药株)；对于CoNS，该试验不必常规开展因为克林霉素很少用于治疗凝固酶阴性葡萄球菌；大多数医院相关MRSA是克林霉素耐药的；大多数社区相关MRSA是克林霉素敏感的(msrA 基因型)；克林霉素可以口服给药。第49页，共54页，编辑于2022年，星期一万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌（VRSA）耐药是由于耐药是由于耐药是由于耐药是由于 从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（从万古霉素耐药肠球菌（VREVRE）中获得）中获得）中获得）中获得vanAvanA基因基因基因基因 美国报道例数美国报道例数美国报道例数美国报道例数 9 9个患者个患者个患

25、者个患者检测检测检测检测 大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测大多数标准方法均可检测菌落形态菌落形态菌落形态菌落形态 典型金葡菌典型金葡菌典型金葡菌典型金葡菌第50页，共54页，编辑于2022年，星期一vanA从VRE转至金葡菌vanvanA第51页，共54页，编辑于2022年，星期一纸片扩散法折点纸片扩散法折点葡萄球菌葡萄球菌-万古霉素万古霉素CLSI CLSI 文件文件文件文件SusceptibleSusceptible敏感敏感敏感敏感IntermediateIntermediate中介中介中介中介ResistantResistant耐药耐药耐药耐药M100-

26、S18 2008M100-S18 2008 1515-2016 2016年年年年-CLSI M100-S19.Table 2C.CLSI M100-S19.Table 2C.对于金黄色葡萄球菌对于金黄色葡萄球菌 必须用必须用MICMIC法检测万古霉素法检测万古霉素第52页，共54页，编辑于2022年，星期一肠球菌肠球菌高水平氨基糖苷类耐药筛查高水平氨基糖苷类耐药筛查纸片扩散法120 g 庆大霉素;300 g 链霉素 10 mm=无高水平氨基糖苷类耐药MIC筛查庆大霉素:500 g/ml 链霉素:1000 g/ml(肉汤)2000 g/ml(琼脂)第53页，共54页，编辑于2022年，星期一万古霉素耐药肠球菌（VRE）表型VRE屎肠球菌中居多屎肠球菌中居多vanA-高水平耐药高水平耐药(MIC 256 g/ml)vanB-中等水平耐药中等水平耐药(MIC 16-256 g/ml)低水平万古霉素耐药低水平万古霉素耐药vanC-(MIC 2-16 g/ml)vanC天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌天然存在于鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌菌株不引起院内爆发，菌株不引起院内爆发，vanC基因不易于传播基因不易于传播纸片扩散法实验可能检测不出纸片扩散法实验可能检测不出第54页，共54页，编辑于2022年，星期一