生物化学经典实验——DNA琼脂糖凝胶电泳.ppt

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1、DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳实验原理实验原理v琼脂糖为链状多糖琼脂糖为链状多糖琼脂糖为链状多糖琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束绳状琼脂糖束绳状琼脂糖束绳状琼脂糖束大网孔型凝大网孔型凝大网孔型凝大网孔型凝胶胶胶胶 分离、鉴定、纯化分离、鉴定、纯化分离、鉴定、纯化分离、鉴定、纯化DNADNAv在在 pH 值为值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。向正极移动。v采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构

2、象不同的核酸分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。段检测其大小的目的。实验原理实验原理v当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色染色,在紫外光下至少可以检出在紫外光下至少可以检出1-10ng的的DNA条带条带,从而可以确定从而可以确定DNA片段在凝胶片段在凝胶中的位置。中的位置。v此外此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带条带,用于以后的克隆操作。用于以后的克隆操作。v该技术

3、操作简便快速，可以分辨用其它方法（如该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。片段。影响影响DNA迁移率的因素迁移率的因素v影响影响影响影响DNADNA迁移率的因素：迁移率的因素：迁移率的因素：迁移率的因素：DNADNA分子的大小、构分子的大小、构分子的大小、构分子的大小、构 象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等v缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液pHpHDNA DNA pIpI，DNADNA带负电荷，迁移率与带负电荷，迁

4、移率与带负电荷，迁移率与带负电荷，迁移率与 分子量对数成反比分子量对数成反比分子量对数成反比分子量对数成反比vDNADNA分子构象影响迁移率：共价闭环分子构象影响迁移率：共价闭环分子构象影响迁移率：共价闭环分子构象影响迁移率：共价闭环DNADNA 线线线线 状状状状DNADNA 开环开环开环开环DNADNAvDNA片段越长，泳动速度越慢片段越长，泳动速度越慢v在低电压时，在低电压时，泳动速度与电场强度成正比泳动速度与电场强度成正比 不同浓度琼脂糖分离不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围分子的范围琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（琼脂糖浓度（W/V,%W/V,%）分离范围（分离范围（分离范围（分

5、离范围（kbkb）0.3 5-600.3 5-60 0.6 1-20 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 2.0 0.1-3DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。v嵌入染料的存在嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状状和带缺口的环状DNA，

6、使其刚性更强，使其刚性更强,还会使还会使线状线状DNA迁移率降低迁移率降低15。v 离子强度影响离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的的电泳迁移率。在无离子存在时电泳迁移率。在无离子存在时(如误用蒸馏水配制如误用蒸馏水配制凝胶凝胶),电导率最小电导率最小,DNA几乎不移动几乎不移动;在高离子在高离子强度的缓冲液中强度的缓冲液中(如误加如误加10电泳缓冲液电泳缓冲液),则电导则电导很高并明显产热很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或严重时会引起凝胶熔化或DNA变变性。性。琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中DNA的观察的观察溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙锭（溴化乙

7、锭（EBEB）DNADNA：紫外光下紫外光下紫外光下紫外光下 桔红色荧光桔红色荧光桔红色荧光桔红色荧光主要实验器材主要实验器材电泳仪电泳仪电泳仪电泳仪电泳槽电泳槽电泳槽电泳槽缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液琼脂糖琼脂糖琼脂糖琼脂糖凝胶槽凝胶槽凝胶槽凝胶槽梳子梳子梳子梳子取液器取液器取液器取液器溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝电泳槽结构电泳槽结构缓冲溶液配制表缓冲溶液配制表电泳指示剂电泳指示剂v 核酸电泳常用的指核酸电泳常用的指示剂有两种示剂有两种:溴酚蓝溴酚蓝(bromophenol blue,Bb)呈蓝紫色；二甲呈蓝紫色；二甲苯腈苯腈(xylene cyanol,Xc）呈蓝色，它携呈蓝色，它携带的电荷量比溴

8、酚带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。迁移率比溴酚蓝慢。胶浓胶浓胶浓胶浓（%）溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝溴酚蓝二甲苯腈二甲苯腈二甲苯腈二甲苯腈0.60.61kb1kb1 10.6kb0.6kb2kb2kb1.41.40.2kb0.2kb1.6kb1.6kb2 20.15kb0.15kb操作步骤操作步骤v琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EBEBv凝胶板的制备：加梳子，倒胶凝胶板的制备：加梳子，倒胶凝胶板的制备：加梳子，倒胶凝胶板的制备：加梳子，倒胶v样品的制备：样品样品的制备：样品样品的

9、制备：样品样品的制备：样品+1/5+1/5体积溴酚蓝体积溴酚蓝体积溴酚蓝体积溴酚蓝v加样：加样端为负极（黑）加样：加样端为负极（黑）加样：加样端为负极（黑）加样：加样端为负极（黑）v电泳：电泳：电泳：电泳：5V/cm5V/cmv观察：紫外灯下观察，照相观察：紫外灯下观察，照相观察：紫外灯下观察，照相观察：紫外灯下观察，照相溶溶 胶胶准备胶槽准备胶槽凝胶冷却至凝胶冷却至凝胶冷却至凝胶冷却至5050CC，加，加，加，加EBEB至终浓度至终浓度至终浓度至终浓度0.50.5g/mlg/ml铺铺 胶胶凝胶凝固后取出梳子凝胶凝固后取出梳子加电泳缓冲液加电泳缓冲液准备样品准备样品点点 样样电电 泳泳注意观察溴酚蓝染液的迁移注意观察溴酚蓝染液的迁移紫外灯下观察电泳结果紫外灯下观察电泳结果照照 相相