基因工程的应用 (13).ppt

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1、质粒载体PART第三章03第二节 质粒载体一、质粒（plasmid）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。一、质粒（plasmid）质粒DNA能自主复制，是能独立复制的复制子（autonoumous replicon）。一个质粒在一个细胞中的存在数目称为质粒的拷贝数。按质粒复制调控和拷贝数可分为两类：严紧控制型（stringent control）：其复制与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中 只有一个到十几个拷贝；松弛控制型（relaxed control）：其复制与宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。1.质粒的一般生物学特性（

2、1）质粒分子的大小：（2）质粒DNA的复制：1200 kb一、质粒（plasmid）质粒具有不亲和性（incompatibility）是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主细胞内。在细胞增殖过程中有一种会被逐渐排斥掉。这样的两种质粒称为不亲和 质粒。1.质粒的一般生物学特性（3）质粒的不亲和性：一、质粒（plasmid）在自然条件下，许多质粒可以通过细菌接合的作用转移到新宿主细胞内。它需要移动基因mob、转移基因tra、顺式作用元件bom及其内部的转移缺口位点nic。如F因子 1.质粒的一般生物学特性（4）质粒 具有转移性：一、质粒（plasmid）是筛选的标

3、志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。2.质粒载体必须具备的基本条件（1）具有复制起点（ori）（2）具有抗菌素抗性基因用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。（3）若干限制性内切酶的单一位点：一、质粒（plasmid）2.质粒载体必须具备的基本条件（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。一、质粒（plasmid）3.质粒的种类（1）依据能否在宿主细胞中表现出形状：显性质粒：指宿主细胞由于含有某种质粒而呈现出新的性状。如含有抗生素的抗性质粒（R质粒）、产大肠杆菌素的Col质粒等 隐性质粒：是指宿主细胞含有某种质粒，但无异样形状表现，目前的检测手段还未能检测出 因含该基因而导致性状、宿主

4、代谢物等的改变。（2）依据质粒的复制类型：严紧控制型的质粒和松弛控制型的质粒。（3）依据质粒迁移性质：接合质粒：能自我转移的质粒。非接合质粒：不能自我转移。二、重要的质粒载体（1）天然质粒的局限性 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：pSC101 9 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 TcrColE1 6.5 kb 拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性

5、标记基因 Apr二、重要的质粒载体ColE1重要的质粒载体pBR322pUC18/19二、重要的质粒载体 1.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。（1）元件来源 复制起点 oripMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点 Ampr 基因pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr 基因pSC101的Tetr 基因。二、重要的质粒载体 1.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。（2）长度氨苄青霉素和四环素抗性。（3）选择标记（4）克隆位点4363bp24个克隆位点。二、重要的质粒载体 1.pBR322：F.Boliv

6、ar和R.L.Rodriguez人工构建载体。（5）pBR322的优点 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamH IAmp中存活但在Tet中死亡外源基因Pst ITet中存活但在Amp中死亡二、重要的质粒载体 分子小，克隆能力大 载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。高拷贝数 氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全 失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。二、重要的质粒载体（6）pBR322的缺点保留了转移蛋

7、白（mob）的作用位点。1.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别，如果再有F质粒的参与，就有可能转移。二、重要的质粒载体（7）PBR322的改进 删除mob识别位点 1.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。pAT153：从pBR322上切去HaeII片断，既除去了mob识别位点，又增加质粒的拷贝数。（如质粒pBR327、pAT153等）。二、重要的质粒载体（7）PBR322的改进 改造EcoR I 位点 1.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建载体。

8、pBR325：使EcoRI 也成为插入失活型位点。在pBR322位点上接入一段来自噬菌体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。cmlr上也带一个EcoRI位点。二、重要的质粒载体 2.pUC系列University of California的J.Messing和J.Vieria于1978年，在pBR322的基础上改造而成。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19二、重要的质粒载体（1）元件来源 复制起点pBR322的 ori但其上失去了克隆位点。Ampr 基因 lacZ的启动子大肠杆菌 lacZ基因大肠杆菌lacZ的-肽链序列，是LacZ 的氨基端片断。pBR322的Ampr基因二、重要的质粒载体（2）长度（3）克隆位点（4）选择标记约2.7kb10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。二、重要的质粒载体（5）pUC系列载体的优点 更小的分子量：选择方便 克隆便利 测序方便如pUC18为2682bp，pUC8为2750bp。X-gal显色、抗菌素双重直接选择。具有多克隆位点（MCS），使有两个不同粘性末端的外源DNA方便地插入。THANK YOU感谢聆听