纤维素霉的固态培养及酶活力的测定(学生实验指导).docx

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1、专业试验： 纤维素酶的固态发酵及酶活力的测定一、试验目的：1. 学习固态发酵生产纤维素酶的方法；2. 把握纤维素酶测定的方法；3. 了解不同条件对纤维素酶活力的影响。二、试验原理纤维素是地球上含量最丰富的有机化合物。据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的纤维素最高达 1. 7 亿 t。其中大局部尚未被合理利用。目前，我国约有一半以上的农作物秸秆在田间地头被白白烧掉。可见，利用纤维素酶水解农作物秸秆等废弃物，使其转化为酒精、粮食和化学制品，具有巨大的经济价值和现实意义。纤维素酶能将自然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖，然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤

2、维素酶效率低下，另一方面，纤维素酶多是承受纯的纤维素粉、无机盐等配制而成的培育基进展液态发酵，对培育基要求高，酶系不全且易造成环境污染等问题，在实际进展大规模生产纤维素酶中还有较多困难。利用廉价的原料，承受固态发酵技术，可望有助于进一步降低纤维素酶的生产本钱。三、试验材料和仪器1、材料： 麸皮麸皮粉碎，过1 mm筛；滤纸；产纤维素霉菌种；酒精95；浓硫酸；蛋白胨；羧甲基纤维素钠；NH4NO3；酵母膏；刚果红；3，5-二硝基水杨酸，乙酸等。1菌种保藏培育基，PDA琼脂。22种子培育基，麸皮2，(NH ) SO 0.2，蛋白胨0.1，KH PO 0.1 ，4 24CaCO30.1%，自然pH，50

3、 mL三角瓶装培育基5 mL，121 灭菌，30 m in。3发酵培育基:纤维素材料90，麸皮10，(NH ) SO 2.5，蛋白胨0.5，4 24水250 mL，250 mL三角瓶装干料10g，121灭菌20 min。40.1M乙酸乙酸钠缓冲溶液pH=4.8溶液A：量取冰醋酸6mL，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000mL，制成0.1M醋酸钠溶液。使用时以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。（5） DNS显色剂称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500mL蒸馏水中，加热不超过50，于热溶液中依次参加3，5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 2

4、1.0g，加热搅拌，使之溶解，再参加苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。（6） CMC1% 准确称取1.000g羧甲基纤维素钠，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100mL。（7） 葡萄糖标准溶液 1.0mg/mL：称取1.000g葡萄糖AR(105枯燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000mL，冰箱保存备用。（8） 滤纸条：1cm6cm 华滤纸。2、仪器：生化培育箱；水浴锅；天平；分光光度计；接种环；试管；三角瓶； 比色管。四、试验方法和步骤1、斜面培育纤维素酶生产菌种接入斜面培育基中，在肯定 30下培

5、育 56d，观看和记录纤维素酶生产菌生长的典型现象。斜面孢子液的制备吸取 5mL 蒸馏水于斜面试管中，接种环刮洗孢子，计数。锥形瓶固态发酵接种 5mL 孢子悬浮液107108 个/mL于装有固体产酶培育基中，置于生化培育箱中，以待测的温度和时间进展培育。考察不同因素对酶活的影响。发酵完毕后置于 45烘箱中枯燥过夜。4、酶活力的测定（1） 粗酶液的制备称取 1g 枯燥固态发酵曲，参加 10 倍的 0.1mol/L pH4.8 的乙酸缓冲液，室温下浸泡 4h，于 4000r/min 离心 15min，取上清液测定酶活。（2） 酶活的测定标准曲线的绘制依据实际测定的酶液吸光值，对应当曲线可以查出相应

6、的酶活力分别吸取 1mg/mL 标准葡萄溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别定容至 50mL。再分别吸取上述溶液各 1.5mL 于比色管中，各加 1.5mL3,5 一二硝基水杨酸溶液， 煮沸 5min另作 1 管比照，取 1.5mL 蒸馏水，加 1.5mL3,5 一二硝基水杨酸溶液， 同样煮沸 5min。冷却后，用分光光度计在 540nm 波长下比色，以光密度做纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫摩尔数酶活力为横坐标，绘制标准曲线。羧甲基纤维素酶活CMCase测定取 1mL 酶液稀释 10 倍另取 1mL 酶液在沸水浴中煮 20min 灭活比照，参加 1mL pH=4.8 的

7、1%CMC-Na 溶液，置于 50中恒温反响 30min，然后参加 1mL DNS，在沸水浴中显色5min，冷却，定容至25mL，摇匀，测540nm 吸光度以灭活的的酶液经同样操作后作为比照。 滤纸酶活的测定取 1mL 酶液稀释 10 倍加 1mL0.1mol/L pH4.8 的醋酸缓冲液，预热到 50， 参加 1 条 1cm6cm 华滤纸约 50mg，50保温 1h，取出，参加1mL DNS，在沸水浴中显色 5min，冷却，定容至 25mL，摇匀，测 540nm 吸光度以灭活的的酶液经同样操作后作为比照。在上述条件下，1h 内由底物生产 1 mol 葡萄糖所需的酶量定义为 1 个酶活力单位U

8、。酶活计算公式：酶活力U/g葡萄糖含量mg酶液定容总体积mL5.56/反响液中酶液参加量mL样品重g时间h 式中，5.56 为 1mg 葡萄糖量底物物质的量 mol。5、各种因素对产酶的影响碳源羧甲基纤维素酶活滤纸酶活FPAU(U/g)CMCase(U/g)杂草加麸皮杂草不加麸皮（1） 不同碳源对产酶的影响竹屑滤纸（2） 不同氮源对产酶的影响氮源羧甲基纤维素酶活滤纸酶活FPAU(U/g)CMCase(U/g)(NH ) SO 0.54 24蛋白胨 2尿素 0.5 酵母膏 0.5（3） 不同装瓶量对产酶影响装瓶量羧甲基纤维素酶活滤纸酶活FPAU(U/g)CMCase(U/g)5g10g15g 3

9、0g（4） 不同接种量对产酶影响接种量羧甲基纤维素酶活滤纸酶活FPAU(U/g)CMCase(U/g)0.512.55培育基原始 pH羧甲基纤维素酶活滤纸酶活FPAU(U/g)（5） 不同初始 pH 对产酶的影响CMCase(U/g)3.54.55.56.5（6） 不同培育温度对产酶的影响不同培育温度羧 甲 基 纤 维 素 酶 活 滤纸酶活FPAU(U/g)CMCase(U/g)25303540五、试验结果1、写出固态发酵生产纤维素酶的主要步骤。2、计算发酵所得纤维素酶的酶活。3、依据试验结果对影响纤维素酶生产的主要条件进展分析，得出结论。六、思考题1、固体发酵生产纤维素酶有哪些优势？2、请查阅相关资料，阐述纤维素酶是如何作用于纤维素的？3、请查阅相关资料，阐述纤维素酶酶活力测定的原理。