不同酶对大豆蛋白结构功能的影响.ppt

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1、1不同酶对大豆蛋白结构功能的影响不同酶对大豆蛋白结构功能的影响主要内容：主要内容： 大豆蛋白的简介 不同酶解对大豆蛋白的功能性质（水解度、溶解性、乳化性及乳化稳定性、起泡及泡沫稳定性、表面疏水性）的影响 不同酶解对大豆蛋白结构的影响 FT-IR光谱分析 电位分析 SDS-PAGE电泳分析2 大豆蛋白作为大豆中最主要的营养成分，是食用源优质植物蛋白质，占大豆干基含量的40%以上，因其构成中含有人体所需8种必需氨基酸，且氨基酸比例平衡，是理想的食用蛋白资源。 大豆分离蛋白(soybean protein isolate，SPI)是大豆的重要组分，它是在低温下将豆粕除去大豆油和水溶性非蛋白成分后，得

2、到的一种蛋白质含量不少于90%的混合物，其组成、结构和性质基本代表纯的大豆蛋白。大豆分离蛋白的主要由C、H、O、N、s和P元素组成，还含微量的金属元素，如Zn、Mg、Fe及Cu等3大豆分离蛋白的组分大豆分离蛋白的组分4大豆分离蛋白功能特性大豆分离蛋白功能特性 大豆蛋白的功能性可分为三类：第一类为蛋白质的水合特性，包括：蛋白质的持水性、溶解性、分散性、湿润性、溶胀性及粘着性：第二类为与蛋白质蛋白质交互作用相关的功能性质，包括蛋白质的凝胶性、聚沉性及面筋等的形成；第三类为蛋白质表面活性，主要是指蛋白质的乳化活性、界面张力、表面张力及起泡性等。5大豆分离蛋白的制备大豆分离蛋白的制备 大豆分离蛋白的制

3、备工艺采用传统的碱溶酸沉法，将脱脂豆粕按1:15的质量比与水混合，用2mol/L NaOH调pH值至8.0，搅拌1.5h后，将其悬浮液在4条件下10000g离心30min，取上清液用2mol/L HCI调pH值至4.5。静置后在4条件下6000g离心30min，取蛋白沉淀水洗2次，最后取沉淀分散于水中并用2mol/L NaOH调pH值至7.0。再在4条件下10000g离心30min，除去少量的不溶物，将其蛋白溶液冷冻干燥后粉碎即得粉末状大豆分离蛋白。所得大豆分离蛋白中蛋白质含量为84.32%，水分含量为3.19%，灰分含量为5.88%。6酶处理酶处理 将大豆蛋白用蒸馏水配制成浓度为5%的溶液，

4、置于反应器中，于水浴锅中设定一定温度，并调节适当酸碱度，此时加入酶制剂，进行计时水解反应，反应进行中控制温度、pH保持恒定，一定时间后立即加热使酶灭活终止反应，最后将酶解液进行冷冻干燥待用。7不同酶随水解时间对大豆分离蛋白水解度的影响不同酶随水解时间对大豆分离蛋白水解度的影响8不同酶解对大豆分离蛋白乳化性的影不同酶解对大豆分离蛋白乳化性的影响响9 不同酶对大豆分离蛋白酶解产物乳化稳定性的影响不同酶对大豆分离蛋白酶解产物乳化稳定性的影响10不同酶解对大豆分离蛋白起泡性的影响不同酶解对大豆分离蛋白起泡性的影响11不同酶解对大豆分离蛋白泡沫稳定性的影响不同酶解对大豆分离蛋白泡沫稳定性的影响12不同蛋

5、白酶酶解处理后大豆分离蛋白表面疏水性不同蛋白酶酶解处理后大豆分离蛋白表面疏水性13FT-IR光谱分析光谱分析 碱性蛋白对大豆蛋白结构的影响14大豆分离蛋白的去卷积酰胺大豆分离蛋白的去卷积酰胺I I带二阶导数谱带二阶导数谱15碱性蛋白酶酶解修饰大豆分离蛋白二级结构的碱性蛋白酶酶解修饰大豆分离蛋白二级结构的FT-IR分析分析16利用Peakfit分峰拟合软件对蛋白质酰胺I带进行拟合，结果如下 原始大豆分离蛋白主要由折叠结构组成，螺旋及转角结构含量次之，结构含量最少的为无规卷曲结构。总体而言，碱性蛋白酶酶解处理增大了转角及无规则卷曲结构含量，但减少了螺旋结构组成含量。随着酶解处理时间的延长，大豆分离

6、蛋白的螺旋结构逐渐降低，而增加了无规卷曲结构含量。可以推测，碱性蛋白酶酶解处理后大豆分离蛋白被酶解为更多的多肽是促进了大豆分离蛋白中螺旋结构向无规卷曲结构转变的重要原因。17中性蛋白酶酶解修饰大豆分离蛋白中性蛋白酶酶解修饰大豆分离蛋白FT-IR谱图谱图18利用Peakfit分峰拟合软件对蛋白质酰胺I带进行拟合，结果如下：19 大豆分离蛋白经中性蛋白酶酶解处理后螺旋和折叠结构含量均有所降低，而其他两种结构含量则有所增加；随着酶解处理时间的延长，大豆分离蛋白中螺旋和折叠结构均呈现降低的变化趋势，并主要转变为无规则卷曲结构。这种变化可能与中性蛋白酶底物位点为疏水性芳香族氨基酸有关，而疏水性芳香族氨基

7、酸多包埋于蛋白质内部的螺旋和折叠结构中，因而，中性蛋白酶酶解处理后大豆分离蛋白的螺旋和折叠结构均受到破坏转变为无规则卷曲结构。20木瓜蛋白酶酶解修饰大豆分离蛋白木瓜蛋白酶酶解修饰大豆分离蛋白FT-IR谱谱图图2122木瓜蛋白酶酶解处理总体降低了大豆分离蛋白的螺旋及折叠结构含量，并增加了无规卷曲结构含量。随着酶解时间的延长，螺旋结构含量变化并不明显，而折叠结构含量降低较为显著，并逐渐转变为无规卷曲结构。 通过比较可知，酶解处理后由于更多的多肽形成，酶解处理的大豆分离蛋白中无规则卷曲结构含量总体增加，这些无规则卷曲结构主要是由螺旋及折叠结构转化而来，酶解底物作用位点的不同及水解度的差异是不同蛋白酶

8、酶解作用后二级结构组成差异的主要原因。而更多的无规则卷曲结构也为蛋白质的良好表面性质及乳液稳定性的表达等提供了大量柔性结构单元。由于大豆11s球蛋白及7s球蛋自在酶解后原本有序的二级结构较大程度破坏，其结构识别性较差，因此并未在FT-IR光谱研究及后续蛋白质结构研究中体现。23电位分析电位分析 电位的重要意义在于它的数值与胶态分散的稳定性相关。 电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力的强度的度量。分子或分散粒子越小， -电位(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，毛电位(正或负)越低，越倾向于凝结或凝聚，即吸引力超过了排斥力，分散被破坏而发生凝结或凝聚。24不同蛋白酶酶解修饰大豆

9、分离蛋白的不同蛋白酶酶解修饰大豆分离蛋白的电位电位25 不同蛋白酶对大豆分离蛋白三电位的影响效果不一，中性蛋白酶短时酶解处理后大豆分离蛋白的电位绝对值略有增加，长时酶解下大豆分离蛋白的电位绝对值又有所降低。碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解修饰后大豆分离蛋白的电位绝对值随着酶解时间的延长，呈现先增加后降低的变化趋势，酶解在前30min内电位绝对值的增大与由蛋白质水解后更多极性基团暴露造成的蛋白质表面电势增强有关，而电位绝对值的降低可能与蛋白的聚集有关。26SDS-PAGESDS-PAGE电泳分析电泳分析 SDS-PAGE电泳是一种变性电泳，分离的依据为蛋白质的电荷和分子量的差异性。SDS是一种阴离子表

10、面活性剂，以一定的比例与蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物，这种复合物带有大量的负电荷，从而消除了蛋白质本身所带有的电荷差异，同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，使得蛋白质泳动率只与其分子量有关；另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂(-巯基乙醇)作用下，蛋白质分子内二硫键被打开，蛋白质的亚基分离出来，从而蛋白质亚基的特定谱带被表征出来。27酶解酶解15min后大豆分离蛋白后大豆分离蛋白SDS-PAGE电泳图电泳图28 经过酶解1 5min后可以看出，大豆蛋白的各条带颜色均变浅，表明酶解处理裂解了大豆蛋白形成部分多肽。而相比之下，各种蛋白酶处理下7S球蛋白的相关条带略浅于

11、大豆11 S球蛋白，表明各种蛋白酶优先酶解7S球蛋白组分。比较可知，碱性蛋白酶对7S球蛋白的酶解程度大于其他两种蛋白酶。29酶解酶解60min60min后大豆分离蛋白后大豆分离蛋白SDS-PAGESDS-PAGE电泳图电泳图30 大豆分离蛋白在60min酶解处理后，大豆7S球蛋白和1 lS球蛋白均发生较明显的酶解现象。中性蛋白酶处理后，大豆7S球蛋白对应条带接近于消失表明，该组分在此酶解条件下大豆7S球蛋白已较大程度被酶解。而碱性蛋白酶处理后各组分对应条带明显变浅，也反映出碱性蛋白酶对大豆11S和7S球蛋白组分的酶解作用明显。另外，由SDS-PAGE分析可知，木瓜蛋白酶长时酶解处理并未明显地影响大豆球蛋白组分含量，与水解度部分研究结果一致。31谢谢！32