T_SHRH 022-2019 化妆品保湿功效评价 体外重组3D表皮模型 测试方法.docx

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1、T/SHRH022-2019目次前言21范围32.规范性引用文件33.术语和定义34.试验原则35.试剂及仪器设备36.试验步骤47.结果计算58.结果判定5附录A资料性附录6附录B资料性附录71T/SHRH022-2019化妆品保湿功效评价体外重组3D表皮模型测试方法1范围本标准规定了一种基于体外重组3D表皮模型的化妆品原料及化妆品成品的保湿功效测试方法。本标准可作为化妆品保湿功效测试替代方法之一，也可结合其他方法对化妆品保湿功效进行评价。本标准适用于具有生物学深层保湿作用的化妆品原料及成品的保湿功效测试，不适用于吸湿剂、封闭剂类化妆品。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

2、凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法化妆品安全技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。体外重组3D表皮模型invitroreconstructedhumanepidermismodel采用人原代表皮角质形成细胞，通过组织工程技术在体外重组的皮肤组织，具有与正常皮肤高度相似的复层化结构、生理及代谢功能。4试验原则4.1本标准使用的体外重组3D表皮模型（EpiKutis），具有表皮的复层化结构（基底层、棘层、颗粒层和角质层）和屏障功能。角质细胞内含有丰富的天然保湿

3、因子（NMF），与皮肤保湿功能高度相关。4.2生物学深层保湿是通过一系列的生物化学作用，提升角质细胞内天然保湿因子含量，达到提升皮肤保湿功能的作用。吡咯烷酮羧酸(PyrrolidoneCarboxylicAcid，PCA)与尿刊酸（Urocanicacid，UCA）是NMF的重要组成成分，通过对PCA、UCA的含量分析，可以评价皮肤生物学深层保湿功能。5试剂及仪器设备5.1材料及试剂5.1.1体外重组3D表皮模型（EpiKutis）。5.1.2体外重组3D表皮模型培养液（EpiGrowth培养液）。5.1.3蛋白酶K。5.1.4甲酸铵。5.1.5甲醇（色谱纯）。3T/SHRH022-20195

4、.1.6乙腈（色谱纯）。5.1.7吡咯烷酮羧酸标准品（纯度99%）。5.1.8顺式尿刊酸标准品（Cis-UCA）（纯度99%）。5.1.9反式尿刊酸标准品（Trans-UCA）（纯度99%）。5.1.10去离子水（一级）。5.1.11磷酸盐缓冲液（PBS）。5.2仪器和设备5.2.1超净工作台。5.2.2CO2培养箱：371，51%CO2，95%相对湿度。5.2.3高效液相色谱仪。5.2.4低温高速离心机。5.2.5氮气吹干仪。5.2.6超声波振荡仪。5.2.7超纯水仪。5.2.8旋涡震荡仪。5.2.9分析天平(精度0.1mg)。6试验步骤6.1体外重组3D表皮模型的准备该步骤在超净工作台中进

5、行。每轮测试中，空白对照组和各待测物组均需要1块6孔板，3个体外重组3D表皮模型。标记6孔板，在每个6孔板的第一排孔中各加入0.9mLEpiGrowth培养液。将模型转移至6孔板中，置于CO2培养箱中培养（371、51%CO2、95%相对湿度）。6.2给药待测物的给药方式为模型表面给药，给药量为25L；空白对照组不进行给药处理。模型给药结束后，将6孔板转移至CO2培养箱中，孵育培养24h（371、51%CO2、95%相对湿度）。6.3清洗模型孵育培养结束后，开始清洗程序。用无菌PBS溶液重复清洗模型表面15次，去除残留的待测物。6.4角质层NMF提取4将体外重组3D表皮模型用刀片沿边缘环切后，

6、转移至1.5mL离心管中，并在每管中加入500L蛋白酶K工作液（浓度0.2mg/mL），置于恒温培养箱，50酶解1h。用镊子夹取角质层，置于新的1.5mL离心管中，并在每管中加入250L甲醇，超声波震荡仪震荡30min，频率28KHz。结束后，将离心管放入低温高速离心机，414000rpm离心10min，吸取上清液，转移到新的离心管中，氮气吹干仪吹干，加入250L去离子水，超声波震荡30min。超声结束后，将离心管放入低温高速离心机，12000rpm离心10min，吸取194L上清液到内衬管中，加入5L1M甲酸铵母液及2.5L乙腈震荡混匀，待上机。6.5测定条件6.5.1吡咯烷酮羧酸（PCA）

7、高效液相色谱测定条件如下：a)色谱柱：C18柱，5m，4.6*250mm。4T/SHRH022-2019b）流动相：990mL甲酸铵溶液（20mmol/L）加入10mL乙腈，搅拌均匀，0.45m混合过滤膜过滤，超声15min。c）柱温：30。d）流动相流速：0.4mL/min。e）进样量：40L。f）检测波长：210nm。g）出峰时间：7.1min。6.5.2尿刊酸（UCA）高效液相色谱测定条件如下：a)色谱柱：C18柱，5m，4.6*250mm。b）流动相：990mL甲酸铵溶液（20mmol/L）加入10mL乙腈，搅拌均匀，0.45m混合过滤膜过滤，超声15min。c）柱温：30。d）流动相

8、流速：0.4mL/min。e）进样量：40L。f）检测波长：270nm。g）trans-UCA出峰时间：9.9mincis-UCA出峰时间：15.4min。6.6标准工作曲线绘制按6.5色谱条件检测吡咯烷酮羧酸（PCA）、尿刊酸（cis-UCA、trans-UCA）标准品，并绘制标准曲线。标准品的色谱图参见附录A，标准品的配制方法参见附录B。6.7测定按色谱条件6.5对待测物进行测定，并根据待测物峰面积和标准曲线，计算各待测物中PCA、cis-UCA、trans-UCA的含量。6.8质量控制a)高效液相色谱仪对待测物进行定量测定时，需确认目标物的保留时间和标准品相一致。b)高效液相色谱仪检测需

9、要设置空白试验。7结果计算目标物的总含量=目标物测定浓度总体积。UCA总含量=cis-UCA含量+trans-UCA含量。8结果判定以下条件说明待测物具有保湿功效:与空白对照组相比，待测物PCA含量显著上升，且有统计学显著性差异；与空白对照组相比，待测物UCA含量显著上升，且有统计学显著性差异；如待测物只满足上述部分条件，仍可说明待测物具有保湿功效。5T/SHRH022-2019附录A（资料性附录）A.1PCA标准品的高效液相色谱图A.2trans-UCA标准品的高效液相色谱图A.3cis-UCA标准品的高效液相色谱图6T/SHRH022-2019附录B（资料性附录）标准品溶液的配制及上机前预

10、处理1.PCA标准品的配制用分析天平称取PCA标准品16mg，放入1.5mL离心管中，加入1mL去离子水，旋涡震荡混匀，即为标准品母液（16mg/mL）。采用去离子水对母液进行1000倍稀释，并依次配制标准品工作液，浓度梯度分别为16g/mL、4g/mL、1g/mL、0.25g/mL、0g/mL。2.UCA标准品配置2.1trans-UCA配制用分析天平称取trans-UCA标准品2.4mg，放入1.5mL离心管中，加入1mL去离子水，旋涡震荡混匀，即为标准品母液（2.4mg/mL）。采用去离子水对母液进行1000倍稀释，并依次配制标准品工作液，浓度梯度分别为2.4g/mL、0.6g/mL、0.15g/mL、0.0375g/mL、0g/mL。2.2cis-UCA配制用分析天平称取cis-UCA标准品0.5mg，放入1.5mL离心管中，加入1mL去离子水，旋涡震荡混匀，即为标准品母液（0.5mg/mL）。采用去离子水对母液进行1000倍稀释，并依次配制标准品工作液，浓度梯度分别为0.5g/mL、0.125g/mL、0.03g/mL、0.0075g/mL、0g/mL。2.3.上机前预处理吸取388L各标准品工作液，至对应标号的进样瓶中，并向每瓶中依次补加10L的甲酸铵母液（1M）和5L的乙腈，旋涡混匀，等待上机。_7