T_HSPP 0005-2022 茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程.docx

《T_HSPP 0005-2022 茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《T_HSPP 0005-2022 茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程.docx（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、T/HSPP00052022目次前言.II1范围.-1-2规范性引用文件.-1-3术语和定义.-1-4柑橘裂皮类病毒分类信息.-1-5仪器和试剂.-1-仪器设备.-1-主要试剂.-1-6检测流程图.-1-7检测方法.-1-样品制备.-2-7.1.1种子类.-2-7.1.2种苗类.-2-RNA提取.-2-RT-PCR检测.-2-分子杂交.-2-结果判定.-3-8留样保存与结果记录.-3-留样保存.-3-结果记录.-3-建档.-3-附录A（参考性附录）柑橘裂皮类病毒基本信息.-4-附录B（参考性附录）核酸提取方法.-5-附录C（参考性附录）分子杂交方法.-6-附录D（规范性性附录）柑橘裂皮类病毒检

2、测流程图.-8-IT/HSPP00052022茄科植物携带柑橘裂皮类病毒检测技术规程1范围本文件规定了柑橘裂皮类病毒的检测技术规程。本文件适用于番茄、辣椒、马铃薯等茄科植物种子及种苗中柑橘裂皮类病毒的检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2964植物病毒检测规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4柑橘裂皮类病毒分类信息中文名：柑橘裂皮类病毒学名：Citrusex

3、ocortisviroid类病毒名及缩写：citrusexocortisviroid，CEVd分类地位：马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae），马铃薯纺锤形块茎类病毒属（Pospiviroid）。柑橘裂皮类病毒的基本信息参见附录A。5仪器和试剂仪器设备电子天平（感量0.001g）、植物培养箱、研钵、高压灭菌锅、纯水仪、PH仪、旋涡振荡器、高速冷冻离心机、台式小型离心机、恒温加热器、生物安全柜、制冰机、普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪、各种量程的可调配移液器（2.5L，10L、20L，200L，1000L）、常规冰箱、超低温冰箱等。主要试剂

4、除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。商品化Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、反转录酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、PCR缓冲液、引物和探针、Tris-乙酸电泳缓冲液，硝酸银溶液等。核酸提取相关试剂符合附录B的要求；分子杂交试剂应符合附录C的要求。6检测流程图柑橘裂皮类病毒检测流程图见附录D。检测过程中防扩散、防污染的措施按照SN/T2964中的规定执行。7检测方法-1-引物名称引物序列（5-3）产物大小（bp）CEVd371FCCGGGGATCCCTGAAGGA371CEVd371RGGAAACCTGGAGGAAGTCGT/H

5、SPP00052022样品制备7.1.1种子类每份送检样本中选取100200粒种子，表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，2025、12h/12h光暗交替条件下保湿培养直至萌发。随机抽取叶片1g5g，置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。7.1.2种苗类对于有症状的种苗类样品，选取全部表现症状的叶片；对于无症状的种苗类样品，随机选取。取100g200g叶片置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。RNA提取取制备好的检测样品100mg，按照常规Trizol法提进行总RNA提取；以感染CEVd的茄科植物样本作为阳性对照，以无CEVd茄科

6、植物样本作为阴性对照，同时进行提取。具体操作步骤参见附录B。核酸提取也可选择相应商业化试剂盒。RT-PCR检测7.3.1cDNA合成0.2mLPCR管中加入DEPC处理去离子水10L、模板RNA3L（50ng200ng），随机引物1L，95（或沸水）水浴7min，迅速置冰上冷却3min；然后加5反转录缓冲液4L、10mmol/LdNTPs、40U/LRNAase抑制剂（Rnasin）0.5L、200U/L反转录酶（M-MLV）0.5L，混匀后37水浴1h；反转录结束后瞬时离心，95（或沸水）水浴5min，冰浴3min，直接进行PCR扩增。cDNA合成也可采用相应商业化试剂盒。7.3.2PCR扩

7、增反应体系：0.2mLPCR管中加入10PCRbuffer（含Mg2+）2.5L，dNTPs（10mmol/L）2L，引物（均为10mol/L）各1.0L（见表1），5U/LTaq酶0.5L，模板cDNA3L，加DEPC处理水至总体积25L。每个样品设置两个平行反应，以双蒸水代替模板作为空白对照。表1PCR反应特异性引物及序列反应程序：955min；9530s，5630s，7230s，35个循环；7210min。也可采用一步法RT-PCR商业化试剂盒，反应体系和反应条件可根据说明书进行适当调整。7.3.3琼脂糖凝胶电泳检测制备1.5%琼脂糖凝胶，取1L加样缓冲液与5LRT-PCR反应产物混匀进

8、行点样，采用110V电泳35min后，凝胶成像检测扩增产物。7.3.4测序分析（可选）对RT-PCR扩增产物进行测序，将测得序列与GenBank数据库中已知的CEVd序列进行相似性比对分析，验证样品检测结果。分子杂交采用Roche地高辛标记试剂盒进行核酸探针标记，制备地高辛标记的CEVdRNA探针，放置于-20备用。取3L样品核酸，经变性后点于带正电荷的尼龙膜上，晾干后在交联仪上交联3min。交联固定后的尼龙膜在杂交炉上68进行预杂交1h，然后加入2LRNA探针杂交10h。杂交后进行洗膜，最后按照化学发光法进行杂交检测。具体操作步骤参见附录C。-2-T/HSPP00052022结果判定对照成立

9、的前提下，检测结果按照以下原则进行判定：样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性，可判定样品中携带有柑橘裂皮类病毒；样品RT-PCR检测或分子杂交检测结果为阳性，经测序分析验证与已知的CEVd序列相似性达90%以上，可判断样品携带柑橘裂皮类病毒；样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阴性，可判定样品未携带柑橘裂皮类病毒。8留样保存与结果记录留样保存检出柑橘裂皮类病毒的种子、生长苗木样品以及7.1剩余制样于-80冰箱内保存。样品应保存至少6个月。保存期满后，应经高压灭菌后方可处理。结果记录RT-PCR检测结果电泳照片、分子杂交检测结果照片、测序报告和序列分析结果图应一并保存。建档建立实

10、完整的实验档案，包括样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法、结果及实验人员签字等。-3-AA附录A（资料性附录）柑橘裂皮类病毒基本信息A.1寄主范围芸香科（Rutaceae）、马铃薯（Solanumtuberosum）、番茄（Solanumlycopersicum）、茄子（Solanummelongena）、矮牵牛（Petuniahybrid）、蚕豆（Viciafaba）、胡萝卜（Daucuscarota）、葡萄（Vitisvinifera）、碧冬茄（Petuniahybrid）、菊科（Compositae）、三七草属（Gynura）、柑橘属（Citrus）、香橼（Citrusmedi

11、ca）等。A.2地理分布目前已报道发现CEVd的国家有澳大利亚、斐济、汤加、新西兰、非洲南部、俄罗斯、法国、葡萄牙、西班牙、意大利、土耳其、巴基斯坦、菲律宾、马来西亚、日本、沙特阿拉伯、泰国、以色列、印度、越南、中国等。A.3传播途径通过嫁接、花粉、种子和刀具机械传播。远距离通过种苗调运传播。A.4病害症状柑橘裂皮类病毒在马铃薯及番茄上引起的症状与马铃薯纺锤块茎类病毒相似，在马铃薯造成纺锤状块茎，在番茄上的症状为簇顶。症状的严重性、潜伏期及矮化出现的时间和程度主要由于田间存在不同的CEVd株系。CEVd的株系是根据在不同的砧木/接穗的柑橘上的症状严重程来划分的，弱毒株系存在于叶片中，引起矮化症

12、状，而强毒株系则引起裂皮症状。A.5CEVd基因组特征CEVd基因组为单链环状RNA分子，基因组大小约371nt，GC含量高，分子内部碱基配对形成稳定的杆状或拟杆状二级结构，在一定条件下可形成发夹状变形结构。CEVd基因组包含5个功能区：左末端区(TL)、致病区(P)、中央保守区(C)、可变区(V)和右末端区(TR)。-4-附录B（资料性附录）核酸提取方法B.1核酸提取相关试剂DEPC处理超纯水：取制备好的去离子水500mL，加入500LDEPC摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；1mol/LTris-HCl（pH8.0）：称取12.11gTrisbase，加50mLDEPC处理超纯水溶解，

13、用浓HCl调pH值至8.0，定容至100mL，高温高压灭菌后室温保存；0.5mol/LEDTA（pH8.0）：称取18.61gNa2EDTA2H2O，加80mL处理超纯水溶解，用约2gNaOH调pH值至8.0，加DEPC100L，定容至100mL，摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；10TE（pH8.0）：取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和0.5mol/LEDTA（pH8.0）2mL，加50mLDEPC处理超纯水溶解，定容至100mL，高温高压灭菌后室温保存。B.2核酸提取称取7.1制备的检测样品100mg，转入已灭菌的去RNA酶离心管；立即加入1mLTrizol，涡旋振

14、荡15s，室温静置15min；加400L氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2min，412000r/m离心15min；取上清于新的离心管中，加无加入等体积的异丙醇沉淀，轻微颠倒，-20沉降1h；12000r/m离心15min；弃上清，沉淀中加1mL预冷的75%酒精，上下颠倒10次，12000r/m离心5min，弃上清；瞬间离心20s，吸去多余液体，室温干燥5-10min，加30LDEPC处理的去离子水溶解，-80冰箱保存备用。也可选择市售商品化提取试剂盒进行核酸提取。-5-附录C（参考性附录）分子杂交方法C.1试剂与材料C.1.1核酸杂交相关试剂20SSC：称取175.3gNaCl，88.2g柠檬酸

15、钠2H2O，溶解于800mL去离子水，用HCl调pH值至7.0，最后用定容至1L，高温高压灭菌后室温保存；50Denhardts溶液：称取1gFicoll400，1gPVP-40，1gBSA，溶解于80mL去离子水，定容至100mL，过滤除菌及杂质后-20贮存；预杂交液：6SSC、5Denhardt溶液、50%(w/v)Formamide、0.5%(w/v)SDS、100g/mL鲑鱼精DNA（用前加热变性后加入）；杂交液：预杂交液中加入DIG-RNA探针，稀释成适当浓度；封闭液：将0.73gNaCl，0.24gNa2HPO4，0.1gNaH2PO4，5gSDS溶于80mL水中，定容至100mL

16、，过滤除菌后室温保存；洗涤液I：为1/10稀释的封闭液；洗涤液II：将0.24gTrisbase，1.16gNaCl，0.4gMgCl2溶于160mL水中，用HCl调pH至9.5，定容至200mL，过滤除菌后室温保存；:MOPS缓冲液（10）200mmol/LMOPS(pH7.0)、50mmol/LNaAc、10mmol/LEDTA；Maleicacid缓冲液：100mmolMaleicacid、150mmolNaCl，pH7.5；洗膜缓冲液：100mmolMaleicacid、150mmolNaCl、0.3%(v/v)Tween20，pH7.5；检测缓冲液：100mmolTris-HCl(p

17、H9.5)、100mmolNaCl；抗地高辛的酶标抗体：Anti-DIG-AP；CSPD：25mmolCSPD（用前稀释）；带正电的尼龙膜为AmershamPharmaciaBiotech公司的产品。C.2标记探针2挑取CEVd全长cDNA正向插入的克隆质粒，用Nde对质粒进行酶切线性化处理，获得含有目标片段的线性化重组质粒。采用T7RNA多聚酶进行体外转录随机标记单链RNA探针：取1g线性化质粒，加入4L5转录反应缓冲液、L地高辛（digoxin，DIG）标记dNTPs和2LT7RNA聚合酶、0.5LRNA酶抑制剂，37标记反应2h，反应完成后保存于-20冰箱备用。C.3实验步骤C.3.1样

18、品RNA的提取方法同B.2。C.3.2RNA斑点印迹杂交-6-1）取3LRNA加7L变性缓冲液(33%甲醛、50%去离子甲酰胺和1MOPS)，65水浴15min，冰浴5min，促使核酸变性；2)然后取变性核酸点于带正电荷的尼龙膜上，每次3L，点好后将膜晾干；3）将膜正面朝上置于胶联仪（Hoefer-Uvc500，AmershamBiosciencesCorp.）内，在紫外光强度1200100J/cm2条件下胶联固定3min；4）将膜用6SSC预湿后，放入预杂交液中，在杂交炉（FisherScientificInternationalInc.）68预杂交1h；5）然后将探针煮沸5min，迅速冰上

19、冷却5min，加入到杂交缓冲液中，65杂交10h；6）杂交结束后，将膜取出，用20mL40mL含2SSC和0.1%SDS溶液在室温洗膜5min，重复一次；7）用20mL40mL含0.1SSC和0.1%SDS溶液在68下洗膜15min，重复一次；8）将膜放入杂交袋中用于检测。C.3.3杂交检测采用Roche地高辛检测试剂盒在室温（2025）条件下进行杂交结果的检测。按100cm2膜面积计算试剂用量。1）洗膜后，用洗液冲洗杂交膜；将膜放入在100mL封闭液内封闭30min；2）利用封闭液按1：10000稀释抗体，将膜放入20mL抗体溶液内孵育20min；3）加100mL洗膜液，室温洗膜15min，

20、重复1次；4）加20mL检测液，室温孵育2min5min，重复1次；5）杂交面朝上，加2mLCSPD使其均匀铺在膜上，室温孵育5min，取出膜沥干溶液，用保鲜膜包好；6）5min15min后置于化学发光检测仪内检测光信号。C.4结果判定阴性对照无或弱的杂交信号，阳性对照有强的杂交信号，则结果可靠；杂交信号显著比阴性对照强的判定为阳性样品。-7-附录D（规范性性附录）柑橘裂皮类病毒检测流程图D.1柑橘裂皮类病毒检测流程图检测样品RT-PCR检测和分子杂交检测RT-PCR检测或分子杂交检测阳性检测阳性检测测序分析验证检出柑橘裂皮类病毒与GenBank数据库中已知的CEVd序列进行相似性比对分析，相似性达90%以上检出柑橘裂皮类病毒图D.1柑橘裂皮类病毒检测流程图-8-