免疫磁珠分离技术(IMB)及在食品生产中的应用.pptx

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1、免疫磁珠别离技术免疫磁珠别离技术IMBIMB及在食品生产中的应用及在食品生产中的应用 段旭昌段旭昌 副教授副教授 2013 9 10 2013 9 10提提 纲纲磁性微球磁性微球磁性微球结构、分类及特点磁性微球结构、分类及特点磁性微球的制备磁性微球的制备磁性微球别离技术磁性微球别离技术免疫磁株免疫磁株免疫磁珠结构与性质免疫磁珠结构与性质免疫磁株的特点免疫磁株的特点免疫磁珠的分类免疫磁珠的分类免疫磁珠的制备免疫磁珠的制备免疫磁珠别离技术免疫磁珠别离技术免疫磁珠技术的应用免疫磁珠技术的应用免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠与其它检测手段的联用免疫磁珠与其它检测手段

2、的联用免疫磁珠技术在其他领域的应用免疫磁珠技术在其他领域的应用免疫磁珠技术的优缺点及开展望免疫磁珠技术的优缺点及开展望一一 磁性微球磁性微球是通过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成的具有一定磁性及特殊结构的体积在几纳米到几十微米之间的复合微球。高分子磁性微球外表具有众多外表功能基 团，同时具有磁响应性，在外加磁场作用下具有磁导向功能。目前已广泛用于生物医学、细胞学和别离工程等领域。二二 磁性微球结构、分类及特点磁性微球结构、分类及特点磁性核材料多为磁性核材料多为Fe、Co、Pt、Ni等金属及其氧化物。如等金属及其氧化物。如Fe3O4、-Fe2O3、Me Fe2O3Me=Co、Mn、Ni

3、、BaFe12O19、铁钴合金、铁钴合金Fe-Co和和Ni-Fe。最常用的是。最常用的是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中。其中Fe3O4 应用最多。应用最多。构成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。天然高分子有明构成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。天然高分子有明胶、球蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、淀粉和多种聚糖如纤维素、葡聚糖、胶、球蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、淀粉和多种聚糖如纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、果胶等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯琼脂糖、壳聚糖、果胶等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯及其共聚物、聚酰胺

4、类、聚苯胺及硅烷等。这些材料可单醇、聚丙烯酸酯及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。这些材料可单独用，也可复合使用。独用，也可复合使用。磁性微球外表可根据需要赋予不同的功能基磁性微球外表可根据需要赋予不同的功能基 团团如如OH、COOH、CHO、NH2,SH、CONO2、CONH2、SO3H、SiH3、环氧基、环氧基、CHCl等等，使其表现具有疏水，使其表现具有疏水-亲水、非极性亲水、非极性-极性、带正电荷极性、带正电荷-带负电荷等不同带负电荷等不同物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。物理性质。同时具有磁响应性，在外磁场作用下具有磁导向性。导电聚合磁微球导电聚合磁微球 聚合

5、磁微球聚合磁微球 对磁性微球的要求：粒径均匀、大小适宜、对磁性微球的要求：粒径均匀、大小适宜、比外表积大、吸附力强、具有强的超顺磁比外表积大、吸附力强、具有强的超顺磁性、悬浮均匀稳定性好、不易聚集沉淀、性、悬浮均匀稳定性好、不易聚集沉淀、外表具有多种活性基团、理化性质稳定、外表具有多种活性基团、理化性质稳定、具有较好生物相容性、对细胞、机体、活具有较好生物相容性、对细胞、机体、活性物质损伤小。性物质损伤小。由于环氧基、氯甲基功能基团非常活泼，由于环氧基、氯甲基功能基团非常活泼，不需连接其他活性基团即可与生物配基不需连接其他活性基团即可与生物配基如抗体、抗原等偶联，及其他基团的微如抗体、抗原等偶

6、联，及其他基团的微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。三三 磁性微球的制备磁性微球的制备 磁性微球制备方法：共沉淀法、悬浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子转移自由基聚合法等。1.共沉淀法共沉淀法 金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反响生成磁性高分子微球的方法。金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反响生成磁性高分子微球的方法。2Fe2Fe3+3+Fe+Fe2+2+8OH+8OHFeFe3 3O O4 4+4H+4H2 2O O Pich Pich等先通过单体聚合反响得到等先通过单体聚合反响得到PS-AAEMPS-AAEM颗粒分散剂，再

7、把配制好的颗粒分散剂，再把配制好的Fe3+Fe3+、Fe2+Fe2+溶液参加聚苯乙烯溶液参加聚苯乙烯PSPS-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯AAEMAAEM颗粒的分散剂中，颗粒的分散剂中，然后滴加然后滴加NHNH3 3HH2 2O O。FeFe3 3O O4 4 粒子在粒子在PS-AAEM PS-AAEM 外表沉积，制得外表沉积，制得PS-AAEMPS-AAEM为核心、为核心、Fe3O4 Fe3O4 粒子为壳层的磁性微球。微球的磁性能通过改变粒子为壳层的磁性微球。微球的磁性能通过改变FeClFeCl2 2 和和FeClFeCl3 3 的浓度或改变的浓度或改变PS-AAEM P

8、S-AAEM 核心的尺寸来控制。核心的尺寸来控制。Xia Xia 等把一定配比的等把一定配比的FeClFeCl2 2、FeClFeCl3 3 与葡聚糖与葡聚糖dextran dextran T-10T-10共混，然后滴加共混，然后滴加NHNH3 3HH2 2O O，在超声连续作用下水浴加热，制得以，在超声连续作用下水浴加热，制得以FeFe3 3O O4 4 为为核、核、dextran dextran 为壳的磁性微球。杨玉东等把一定配比的为壳的磁性微球。杨玉东等把一定配比的FeClFeCl3 36H6H2 2O O、FeClFeCl2 26H6H2 2O O与配体如二亚乙基三胺五乙酸与配体如二亚

9、乙基三胺五乙酸DTPADTPA或乙二氨四乙酸或乙二氨四乙酸EDTAEDTA等组成的等组成的混合液体参加到混合液体参加到7575的葡聚糖的葡聚糖T-10 T-10 溶液中，并快速滴加溶液中，并快速滴加NHNH3 3HH2 2O O，制备了葡聚糖，制备了葡聚糖为壳、氧化铁为核的磁性微球。为壳、氧化铁为核的磁性微球。2聚合法制备磁性微球过程聚合法制备磁性微球过程异相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、悬浮液聚合三种。该法是异相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、悬浮液聚合三种。该法是将磁性粒子用外表改性剂、偶联剂、引发剂等处理后分散到含有将磁性粒子用外表改性剂、偶联剂、引发剂等处理后分散到含有聚合物单体的溶剂中

10、进行聚合反响。通常以磁性粒子为活性中心聚合物单体的溶剂中进行聚合反响。通常以磁性粒子为活性中心进行单体聚合。进行单体聚合。四四四四 磁性微球别离技术磁性微球别离技术磁性微球别离技术磁性微球别离技术MACSMACSMagnetic Activated Cell Magnetic Activated Cell SortingSorting 是将免疫学免疫学+细胞生物学细胞生物学+磁力学结合为一体，磁力学结合为一体，利用磁性微球外表功能基团的专一亲和特性或多孔吸附特性吸附特定组分，然后用外力磁场作用将吸附了特定物质的磁珠加以别离，再经过洗脱磁珠上吸附的目标物质的一种新型别离技术，具有广泛的用途。几种

11、几种DNA别离方法的比较别离方法的比较parationofseveralDNAextractionmethods方法方法传统法传统法鳌合树脂法鳌合树脂法玻璃粉法玻璃粉法磁珠法磁珠法免疫亲和法免疫亲和法DNA提取提取酚酚/氯仿等氯仿等溶剂抽提溶剂抽提Chelex100树脂树脂吸附吸附玻璃粉吸附玻璃粉吸附离心别离离心别离磁珠吸附磁珠吸附磁场别离磁场别离抗原抗体反响抗原抗体反响磁场别离磁场别离适用范围适用范围大多数标本大多数标本DNA提取纯化提取纯化培养及培养及各种临床标本各种临床标本土壤标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，冰冻、陈旧组织，样本含量很少的标样本含量很少的标本本方法

12、评价方法评价DNA纯度高、含纯度高、含量多，但较费时，量多，但较费时，步骤繁琐，用有步骤繁琐，用有机溶剂，有损操机溶剂，有损操作者健康。作者健康。可用于培养标本可用于培养标本和各种临床标本和各种临床标本细菌及局部病毒细菌及局部病毒核酸的提取。核酸的提取。方法简便，可用于方法简便，可用于土壤中细菌芽孢土壤中细菌芽孢DNA的提取，不能的提取，不能彻底除去彻底除去PCR抑制抑制剂。剂。简单、快速，整简单、快速，整个过程不到个过程不到2h，可获得较纯，可获得较纯DNA。适于少适于少量样本。量样本。DNA纯度高，含量纯度高，含量多，适于样本含量多，适于样本含量少标本，单克隆抗少标本，单克隆抗体的制备是关

13、键。体的制备是关键。五五 免疫磁珠免疫磁珠免疫磁珠免疫磁珠IMBIMB也称免疫磁性微球，也称免疫磁性微球，是在磁性微球外表偶联上免疫配基的一是在磁性微球外表偶联上免疫配基的一种磁性微球，是将磁性微球技术和免疫种磁性微球，是将磁性微球技术和免疫学相结合的特殊磁性微球。学相结合的特殊磁性微球。六六 免疫磁珠的结构与性质免疫磁珠的结构与性质 免疫磁珠核心为顺磁性粒子，核心外层包免疫磁珠核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子材料，裹一层高分子材料，最外层是免疫配基。最外层是免疫配基。免疫配基免疫配基 免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球

14、上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其表现出的物理性质也不同，表现出的物理性质也不同，从而可结合不同的免疫配基，从而可结合不同的免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、如抗原、抗体、凝集素、DNA 和和RNA 等。配基必须具有等。配基必须具有生物专一性的特点，生物专一性的特点，而且载体微球与配基结合要不影响或而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性，改变配基原有的生物学特性，保证磁珠的特殊识别功能。保证磁珠的特殊识别功能。免疫磁珠的性质免疫磁珠的性质具有均匀性、超顺磁性及保护性外壳，由磁性载体微球和免疫具有均匀性、超顺磁性及

15、保护性外壳，由磁性载体微球和免疫配基结合而成，外表具有专一亲和性和吸附作用。配基结合而成，外表具有专一亲和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形状具有均一性，免疫磁珠大小和形状具有均一性，可使靶物质迅速有效地结合可使靶物质迅速有效地结合到磁珠上，可使新生成复合物在磁场中具有相同磁响应性，且到磁珠上，可使新生成复合物在磁场中具有相同磁响应性，且行为一致。行为一致。磁珠球形结构可消除与不规则形状粒子间的非特异性结合，顺磁珠球形结构可消除与不规则形状粒子间的非特异性结合，顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，从磁场从磁场移出时磁性消除，移出时磁性消

16、除，磁珠分散，磁珠分散，可方便地进行别离和磁性导向。可方便地进行别离和磁性导向。保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀；保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀；免疫配基可专一性结合反响体系中相应的抗原、抗体、核酸等免疫配基可专一性结合反响体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质。生物活性物质。七七 免疫磁株的特点免疫磁株的特点磁性微球与免疫配基结合牢固。磁性微球与免疫配基结合牢固。不影响或改变免疫配基原有的生物特性和不影响或改变免疫配基原有的生物特性和特异性。特异性。免疫微球的识别专一性。免疫微球的识别专一性。在磁场中具有顺磁性，离开磁场磁性消失，在磁场中具有顺磁性，离开磁场磁性消失，易于分

17、散易于分散。由于聚苯乙烯磁性微球强度高、外表易进行化学维修饰，是由于聚苯乙烯磁性微球强度高、外表易进行化学维修饰，是比较理性的制造免疫磁珠的材料。比较理性的制造免疫磁珠的材料。八八 免疫磁珠的分类免疫磁珠的分类 根据磁珠在磁场中受力大小及磁珠体积，分为小磁珠和大磁珠。大磁珠：1-5um，粒径较大、悬浮稳定性差、易沉淀、比外表积小、吸附能力低、吸附活性配基少、对细胞影响大，特别是阳性分选时需将磁珠与细胞解离前方可进行下一步实验。但磁力强，无需特殊别离柱即可实现样品别离，别离速度快、过程简单、成本低。小磁珠：50nm以下，粒径较小、悬浮稳定、比外表积大、外表吸附活性配基多，只有细胞体积的万分之一，

18、对细胞表型和功能影响小，不影响细胞的后续培养。但磁力弱，需特殊别离柱才能实现样品别离，别离速度慢，成本高九九 免疫磁珠的制备免疫磁珠的制备免疫磁珠的制备是将磁性微球和抗体等配基结合而成。磁性微球与抗体的连接方式有共价结合和吸附结合两种方式。共价结合：共价结合：依靠磁珠外表的活性基团如-CHO、-COOH等与抗体Fab段上的-NH2共价反响和结合吸附结合：吸附结合：依靠磁珠巨大的比外表与抗体见得非特异性吸附而结合。共价结合的牢固度远远大于吸附结合牢固度。共价结合的牢固度远远大于吸附结合牢固度。制备方法：制备方法：先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结合，然后别离

19、免疫磁珠分散于缓冲溶液中可以使用。十十 免疫磁珠别离技术免疫磁珠别离技术免疫磁珠免疫磁珠 immunomagnetic bead,IMB别离别离技术：技术：是一种以特异的抗原抗体反响为基础的免疫学磁性微球检测和别离技术。它是以抗体包被的微球磁珠为载体，通过抗体与反响介质中特异性抗原结合，形成抗原抗体复合物，此复合物在外加磁场作用下发生定向移动，从而到达别离抗原的目的。基本原理：磁性微球经过一定处理后基本原理：磁性微球经过一定处理后,将抗将抗体结合到磁珠上体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球标记形成免疫磁性微球标记磁珠磁珠,标记磁珠的抗体与特异性抗原结合标记磁珠的抗体与特异性抗原结合形成抗原形成抗原

20、微球复合物微球复合物,该复合物在磁场中该复合物在磁场中具有与其它组分不同的磁响应性具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作在磁力作用下用下,该复合物发生力学移动该复合物发生力学移动,从而到达别离从而到达别离抗原的目的。抗原的目的。以细胞别离为例图解免疫磁珠技术的原理以细胞别离为例图解免疫磁珠技术的原理以细胞别离为例图解免疫磁珠技术的原理以细胞别离为例图解免疫磁珠技术的原理免疫磁珠标记方法1 1 直接磁珠和直接标记法直接磁珠和直接标记法 通过物理吸附和共价键结合直接将特意性抗体与磁珠耦合，然后再与相应通过物理吸附和共价键结合直接将特意性抗体与磁珠耦合，然后再与相应细胞结合，形成细胞细胞结合，形成细

21、胞-抗原抗原-抗体抗体-磁珠复合物，在外磁场下直接别离目的磁珠复合物，在外磁场下直接别离目的细胞。快速、简单、特异性和细胞得率高，灵敏度低，需制备相应的偶细胞。快速、简单、特异性和细胞得率高，灵敏度低，需制备相应的偶联抗体磁珠。联抗体磁珠。2 2 简介磁珠和间接标记法简介磁珠和间接标记法 使用使用anti-lganti-lg等与磁珠偶联，通过等与磁珠偶联，通过Anti-lgAnti-lg再使磁珠与二抗体偶联，别离细胞时，再使磁珠与二抗体偶联，别离细胞时，先使细胞与一抗特异性结合，然后在与一抗标记磁珠结合，形成细胞先使细胞与一抗特异性结合，然后在与一抗标记磁珠结合，形成细胞-1-1抗抗-2-2抗

22、抗-anti-lg-anti-lg-磁珠复合体，在外磁场下别离目的细胞的方法。该法增加了磁珠复合体，在外磁场下别离目的细胞的方法。该法增加了细胞的洗涤步骤，特异性也会降低。该法一般用于细胞的洗涤步骤，特异性也会降低。该法一般用于没有直标磁珠抗体没有直标磁珠抗体需用几种抗体去除多种细胞需用几种抗体去除多种细胞目的细胞上特异性抗原分子表达水平低。目的细胞上特异性抗原分子表达水平低。MACS微珠微珠直标微珠直标微珠多项选择多项选择微珠微珠间标微珠间标微珠免疫磁珠分选方法阳性分选：阳性分选：运用特异性抗体偶联磁珠直接从细胞混合物中别离目的细胞的分选方法称为positive selection.阳性分选

23、中磁珠标记的细胞即为目的细胞。该法简单、快速、细胞得率和纯度较高。如采用anti-CD14磁珠分选CD14+巨噬细胞。阴性分选：阴性分选：用抗体偶联磁珠去除无关细胞，使目的细胞得以纯化和别离的分选方法称为negative selection.阴性分选中磁珠标记的细胞为非目的细胞。如别离CD4+T细胞时，由于没有专用的CD4+T细胞分选磁珠，可通过anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119标记磁珠去除CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞等，最终而获得较纯的CD4+T细胞。因此阴性分选法适用于：从细胞混合物中去除

24、某种类型细胞。如肿瘤细胞。缺乏针对目的细胞筛选的特异性抗体磁珠时。抗体和目的细胞结合可能诱导细胞活化，影响后续细胞功能分析时。复合分选：复合分选：将阴性分选和阳性分选相结合的分选方法。当目的细胞含量特别低，无法直接进行阳性分选时，可采用阴性分选发先出去其他杂细胞，当目的细胞富集到一定程度时在采用阳性分选发筛选目的细胞。免疫磁珠与细胞解离1 1 过夜培养法：常用方法。将结合磁珠细过夜培养法：常用方法。将结合磁珠细胞置于胞置于10%10%胎牛血清培养基中胎牛血清培养基中375%CO375%CO2 2细胞培养箱中培养细胞培养箱中培养16-24h16-24h，磁珠，磁珠可从细胞上脱落，再通过磁场除去游

25、离可从细胞上脱落，再通过磁场除去游离磁珠，即可获得裸细胞。磁珠，即可获得裸细胞。2 anti-Fab2 anti-Fab抗体法：用抗体法：用anti-Fabanti-Fab抗体与磁珠抗体与磁珠偶联抗体竞争目的细胞，是磁珠与目的偶联抗体竞争目的细胞，是磁珠与目的细胞解离，用磁场除去游离磁珠，即可细胞解离，用磁场除去游离磁珠，即可获得非标记细胞。获得非标记细胞。3 3 酶解法：通过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶酶解法：通过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠与细胞解离，再通过磁场除去游使磁珠与细胞解离，再通过磁场除去游离磁珠，获得裸细胞。离磁珠，获得裸细胞。免疫磁珠别离装置 免疫磁珠别离装置由超强磁铁别离器和别免

26、疫磁珠别离装置由超强磁铁别离器和别离柱组成。磁铁和别离柱的型号多样，配合离柱组成。磁铁和别离柱的型号多样，配合0.5ml0.5ml、1.5ml1.5ml微量离心管，微量离心管，15ml15ml及及50ml50ml离心离心管或试管，和管或试管，和9696孔或孔或384384孔培养板中样品的孔培养板中样品的别离别离 ，以满足不同试验要求。，以满足不同试验要求。十一十一 免疫磁珠别离技术的应用免疫磁珠别离技术的应用别离抗原抗体别离抗原抗体别离蛋白和多肽别离蛋白和多肽别离多糖物质别离多糖物质别离别离DNA和和RNA别离细胞和病毒别离细胞和病毒靶向释药系统的载运靶向释药系统的载运食品有害微生物分析与检测

27、食品有害微生物分析与检测磁珠法别离抗体、抗磁珠法别离抗体、抗原、蛋白、多肽、多原、蛋白、多肽、多糖、糖、DNA、RNA操作操作过程示意图过程示意图MACS Vitalvirus HivMACS Vitalvirus Hiv别离试剂盒别离标记造血别离试剂盒别离标记造血细胞外表的细胞外表的Hiv-1Hiv-1病毒病毒CD44HCD44H异型细胞异型细胞免疫磁珠标记细胞示意图免疫磁珠标记细胞示意图免疫磁珠别离细胞及病毒示意图免疫磁珠别离细胞及病毒示意图十二十二 免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠在食品安全检测中的应用免疫磁珠对病毒细胞具有特异选择性，因此能免疫磁珠对病毒细胞具有特异选择性，因此能

28、用于食品有害微生物的检测。用于食品有害微生物的检测。免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有检测迅速、有选择性别离目的微生物，有效减少背景速、有选择性别离目的微生物，有效减少背景干扰，提高了精准性。同时还能捕获受损伤靶干扰，提高了精准性。同时还能捕获受损伤靶细菌。目前，免疫磁珠技术已广泛用于食品样细菌。目前，免疫磁珠技术已广泛用于食品样品中致病微生物的检测。品中致病微生物的检测。大肠杆菌大肠杆菌O157O157的检测的检测传统别离传统别离E.coli E.coli O157H7O157H7所采用的直接别离法存在着鉴别力差、所采用的直接别离法存在着鉴别力差、抑制

29、杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样品中别离富集采用免疫磁珠技术，能够快速地从各种食品样品中别离富集E.coli E.coli O157H7O157H7，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。，满足流行病学的研究要求和提高控制力度。现在这种免疫磁珠现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健康效劳实验室认定的方法已经被英国公共健康效劳实验室认定为标准的别离方法，我国也已将免疫磁珠法为标准的别离方法，我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌对大肠杆菌O157O157的检的检测纳入国家标准测纳入国家标准GB/T 4789.36-200

30、8GB/T 4789.36-2008和和出入境检验检疫行业标出入境检验检疫行业标准准SN/T 1059.5-2006SN/T 1059.5-2006。已有市售的专用免疫磁珠销售。已有市售的专用免疫磁珠销售。检样检样25gmL+225mL改进改进EC肉汤肉汤mEC+n，均质，均质225mL 免疫磁珠捕获免疫磁珠捕获涂布涂布CT-SMAC平板和改进平板和改进CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板弧菌显色琼脂平板挑取可疑菌落挑取可疑菌落5个个10个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种个，氧化酶阴性，革兰氏阴性杆菌接种TSI MUG-LST 阳性阳性GB/T 4789.36-2008 GB/T 47

31、89.36-2008 免疫磁珠捕获法检测免疫磁珠捕获法检测O157 H7程序程序 阴性阴性 血清学试验血清学试验 非非O157细菌细菌 生化试验生化试验 报告报告36 1oC18h24h36 1oC36 1oC18h24h18h24h1 1增菌增菌2 2免疫磁珠捕获与别离免疫磁珠捕获与别离 1.1.将将EppendorffEppendorff管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用管按样品和质控菌株进行编号，每个样品使用1 1支支EppendorffEppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻管，然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡振荡E.coli O157E.coli

32、 O157免疫磁珠溶液后，用开盖器翻开每支免疫磁珠溶液后，用开盖器翻开每支Eppendo Eppendo-rff-rff管的盖子，每管加人管的盖子，每管加人20 L E.coli 015720 L E.coli 0157免疫磁珠悬液。免疫磁珠悬液。2.2.取取mEC+nmEC+n肉汤增菌培养物肉汤增菌培养物1 mL1 mL，加人到，加人到EppendorffEppendorff管中，盖管中，盖上盖子，然后轻微振荡上盖子，然后轻微振荡10 s10 s。每个样品更换。每个样品更换1 1支加样吸头，质支加样吸头，质控菌株必须与样品分开进行，防止交叉污染控菌株必须与样品分开进行，防止交叉污染。具体操作

33、具体操作 3.3.结合结合:在在18183030环境中，将上述环境中，将上述EppendorffEppendorff管连同磁板架放在管连同磁板架放在Dynal Dynal MXlMXl样品混合器上转动或用手轻微转样品混合器上转动或用手轻微转10 min10 min，使，使E.coli O157E.coli O157与免疫磁珠充与免疫磁珠充分接触。分接触。4.4.捕获捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3 min3 min内不断地倾斜磁板架，确内不断地倾斜磁板架，确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，在保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来，此时，

34、在EppendorffEppendorff管管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。5.5.吸取上清液吸取上清液:取取1 1支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻支无菌加长吸管，从免疫磁珠聚集物对侧深人液面，轻轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确轻吸走上清液。当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时，应放慢速度，以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠，则应将其放回到EppendorffEppendorff管中，并重复管中，并重复4 4步骤。每个样品换用步骤。每个

35、样品换用1 1支无菌加长吸管。支无菌加长吸管。6.6.洗涤洗涤:洗涤免疫磁珠混合物，重复上述步骤洗涤免疫磁珠混合物，重复上述步骤 4 6 4 6 和和4 5 4 5。7.7.免疫磁珠悬浮免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在将免疫磁珠重新悬浮在100 L PBS-Tween 20100 L PBS-Tween 20洗洗液中。液中。8.8.涂布平板涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取用漩涡混合器将免疫磁珠混匀，用加样器各取50 L50 L免疫磁珠悬液分别转移至免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMACCT-SMAC平板和改进平板和改进CHROMagar CHROMagar O157O157弧

36、菌显色琼脂平板一侧，再用无菌涂布棒将免疫磁珠涂弧菌显色琼脂平板一侧，再用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半，用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂外表布平板的一半，用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂外表水分完全吸收后，翻转平板，于水分完全吸收后，翻转平板，于3636士士1 01 0培养培养18-24 h 18-24 h。菌落识别菌落识别 在在CT-SMACCT-SMAC平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无平板上，典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色色菌落，中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的菌落为红色发酵山梨醇的菌落为红色;在改在改CHROMa

37、garO157CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小的菌落，中心呈淡紫色一紫红色，边缘无色或浅灰色。色一紫红色，边缘无色或浅灰色。初步生化试验初步生化试验:在在CT-SMACCT-SMAC和改进和改进CHROMagarO157CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板上挑取弧菌显色琼脂平板上挑取5 5个个1010个个典型或可疑菌落，分别接种典型或可疑菌落，分别接种TSITSI琼脂，同时接种琼脂，同时接种MUG-LSTMUG-LST肉汤，于肉汤，于3636士士11培养培养18h24h18h24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。

38、在。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSITSI琼脂中，琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈阳性反响呈黄色，产气或不产气，不产生硫化典型菌株为斜面与底层均呈阳性反响呈黄色，产气或不产气，不产生硫化氢氢H2SH2S。置。置MUG-LSTMUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳肉汤管于长波紫外灯下观察，无荧光产生者为阳性结果，有荧光产生者为阴性结果性结果，有荧光产生者为阴性结果;对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养对分解乳糖且无荧光的菌株，在营养琼脂平板上分纯，于琼脂平板上分纯，于3636士士11培养培养18h24h18h24h，并进行鉴定。，并进行鉴定。FratamicoFratam

39、ico等将兔抗等将兔抗E.coli O157H7E.coli O157H7多克隆抗体连接到羊抗兔多克隆抗体连接到羊抗兔IgGIgG包被的磁珠上，从食物增菌培养液中别离包被的磁珠上，从食物增菌培养液中别离O157H7O157H7菌株，菌株，再将带菌的磁珠接种到培养基上，参加荧光素标记的再将带菌的磁珠接种到培养基上，参加荧光素标记的O157H7O157H7抗血清，在荧光显微镜下观察，此法敏感性为抗血清，在荧光显微镜下观察，此法敏感性为10cfu/mL10cfu/mL增菌培养液。增菌培养液。DecoryDecory等建立了免疫磁珠等建立了免疫磁珠-免疫脂质体免疫脂质体IMB/ILIMB/IL荧光试验

40、方荧光试验方法，可在法，可在8h8h内快速检测出多种液态样品水样、苹果汁、苹果内快速检测出多种液态样品水样、苹果汁、苹果酒中低至酒中低至1cfu/mL1cfu/mL的的E.coli O157H7E.coli O157H7，而传统微生物学方法，而传统微生物学方法不能从阴性样本中区分出不能从阴性样本中区分出E.coli O157H7E.coli O157H7感染样本。感染样本。单核细胞增生李斯特菌的检测单核细胞增生李斯特菌的检测 传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长，约514d，步骤，步骤繁琐且灵敏度低，而繁琐且灵敏度低，而IMB技术的优点在于在较低的菌液浓

41、度技术的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时时也可以通过免疫磁珠的富集作用进行检测，缩短了检测时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。2008年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法年，我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫行业标准中纳入了出入境检验检疫行业标准中SN/T 0184.3-2008。检样检样25gmL对对225mLFB1増菌液増菌液3030 士士1，24h24h士士1h1h 1mL转种转种10mL FB2増菌液増菌液 35 35，24h24h士士1h1h通过免疫磁珠捕获

42、李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤通过免疫磁珠捕获李斯特菌，然后再用灭菌缓冲液洗涤用用0.1mL的灭菌缓冲液重新制成悬液的灭菌缓冲液重新制成悬液吸取吸取50uL免疫磁珠悬液划线于免疫磁珠悬液划线于CHROMagar 显色培养基，显色培养基，OXA/PALCAM琼脂平板琼脂平板35 +1,24h28h 各挑选各挑选5个典型菌落个典型菌落接种于接种于TSA-YE琼脂平板，纯培养琼脂平板，纯培养 鉴定和确认试验鉴定和确认试验 单增李斯特菌的检测程序与方法单增李斯特菌的检测程序与方法1 1样品制备样品制备2 2增菌增菌3 3免疫磁珠别离免疫磁珠别离IMSIMS1 1免疫捕获免疫捕获混增菌培养液混增菌培养

43、液.沉淀所有的粗糙食物残渣沉淀所有的粗糙食物残渣.从增菌培养液中移取从增菌培养液中移取1mL1mL上层液体上层液体要尽可能防止移取到食物颗粒和脂肪颗粒要尽可能防止移取到食物颗粒和脂肪颗粒加人加人EppendorfEppendorf管中管中.加加20L20L准备好的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液准备好的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液。2 2别离别离将将EppendorfEppendorf管固定在磁架的管孔中。管固定在磁架的管孔中。1801800 0轻缓摆动磁架轻缓摆动磁架5 5次次-6-6次次,使免疫磁使免疫磁珠聚集到磁极。小心地翻开磁架上的珠聚集到磁极。小心地翻开磁架上的Eppendo

44、rfEppendorf管管盖管管盖,从磁极对面一侧慢从磁极对面一侧慢慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠。每一个样品换一次枪头慢吸出液体，注意不要接触管壁上的磁珠。每一个样品换一次枪头;加加1mI1mI灭菌的灭菌的PBSPBS，并重新盖好盖子，并重新盖好盖子.将磁极从支架上移走，将磁极从支架上移走，1801800 0轻缓摆动磁架轻缓摆动磁架5 5次次一一6 6次次,使管内各成分混合使管内各成分混合,后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性别离器上移开次。将离心管从磁性别离器上移开.并加并加100L100L灭菌的灭菌的PBSPBS到管

45、中，重悬磁珠。到管中，重悬磁珠。如实验室没有磁性别离器，可以用手摇代替如实验室没有磁性别离器，可以用手摇代替.4.4.别离培养别离培养1 1别离培养别离培养 吸取吸取50L50L免疫磁珠悬液免疫磁珠悬液.加到显色培养基及任一选择性培养基加到显色培养基及任一选择性培养基OXAOXA、PALCAMPALCAM琼脂平板上琼脂平板上.用无菌接种环划线用无菌接种环划线.35.35士士11培养培养22h-48h22h-48h。2 2筛选筛选李斯特氏菌在李斯特氏菌在CHROMagarCHROMagar显色培养基上菌落为蓝色显色培养基上菌落为蓝色.且在其周围形成一且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在个晕环。李

46、斯特氏菌在OXAOXA琼脂平板上生长琼脂平板上生长22h22h后菌落呈现黑色后菌落呈现黑色.直径为直径为1mm.1mm.在其周围形成一个黑色环。培养在其周围形成一个黑色环。培养48h48h，菌落仍呈黑色，菌落仍呈黑色.直径直径2mm-2mm-3mm.3mm.除在菌落周围有一环外除在菌落周围有一环外.在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特在菌落中心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在氏菌在PALCAMPALCAM琼脂平板上与在琼脂平板上与在XAXA琼脂平板上菌落相似。在琼脂平板上菌落相似。在CHROMagarCHROMagar显色培养基及显色培养基及OXAOXA或或PALCAMPALCAM琼脂平板

47、上挑取琼脂平板上挑取5 5个或更多可疑个或更多可疑菌落菌落.接种于接种于TSA-YETSA-YE琼脂平板上琼脂平板上.纯培养后进鉴定。纯培养后进鉴定。5.5.鉴定和确认鉴定和确认SkjerveSkjerve等通过包被单克隆抗体的磁珠从不同食物样品中别等通过包被单克隆抗体的磁珠从不同食物样品中别离李斯特菌，采用将磁珠接种到琼脂平板培养的方法进离李斯特菌，采用将磁珠接种到琼脂平板培养的方法进行菌株鉴定，此法的敏感性为行菌株鉴定，此法的敏感性为102102104cfu/mL104cfu/mL样品。样品。HudsonHudson等研究说明，将免疫磁珠技术与等研究说明，将免疫磁珠技术与PCRPCR结合，

48、结合，24h24h内内即可检出火腿中的单增李斯特菌。即可检出火腿中的单增李斯特菌。沙门氏菌的检测沙门氏菌的检测Notzon等用等用IMB-荧光荧光PCR检测肉类中的沙门氏菌，实验包括检测肉类中的沙门氏菌，实验包括非选择性增菌、免疫磁珠别离、非选择性增菌、免疫磁珠别离、DNA提取及提取及PCR扩增，扩增，1213h即可完成检测过程，即可完成检测过程，IMB-荧光荧光PCR在检测自然感染肉类和在检测自然感染肉类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异性。人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异性。Blackburn 等将用生物素标记的抗沙门菌多价多克隆抗体连接等将用生物素标记的抗沙门菌多价多克隆抗体连接

49、到链霉亲和素包被的磁珠上，以此试剂检测从不同食物中提取到链霉亲和素包被的磁珠上，以此试剂检测从不同食物中提取的活沙门菌。此法的敏感性可达的活沙门菌。此法的敏感性可达105cfu/g 食物，总的检测时食物，总的检测时间从间从5d减少至减少至12d。IMBIMB技术检测沙门氏菌的优点技术检测沙门氏菌的优点适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快速检测，能快速有适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快速检测，能快速有效富集食品基质中的目标病原菌，且有良好的灵敏度和特效富集食品基质中的目标病原菌，且有良好的灵敏度和特异性，检测限可到达异性，检测限可到达110cfu/25g;在检测时间方面可将常规检测方法中的在检测

50、时间方面可将常规检测方法中的72小时检测周期缩小时检测周期缩短至短至40小时，而且能有效减轻过程交叉污染小时，而且能有效减轻过程交叉污染;筛选结果既可以与常规的细菌生化和血清学联用，也可以筛选结果既可以与常规的细菌生化和血清学联用，也可以和显色培养基、荧光和显色培养基、荧光PCR以及微生物全自动鉴定仪器等方以及微生物全自动鉴定仪器等方法联用，为食源性致病菌检测和鉴定提供有效快速筛选技法联用，为食源性致病菌检测和鉴定提供有效快速筛选技术。术。金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌的检测陈伶俐等将人陈伶俐等将人IgG结合到磁珠上，用该磁珠对样品中的金结合到磁珠上，用该磁珠对样品中的金黄色葡萄球菌进行快