PCR引物设计原则的5个要点.pdf

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1、PCR引物设计原则的5个要点PCR引物设计原则PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影晌了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性。长适物要宜引度 引物GC含量要适宜 引物自身引物5端可及引物之以修饰，3间不应存端不可修饰在互补序列兰千PCR引物是人工合成的两段弃核昔酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补PCR产物的特异性取决于引物与模板D;A互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。引物设计要点(1)一般，引物的长度为15-23bp,常用的长度为18-2

2、1bp。过长会导致其延伸温度大千74C,不适千Taq酶进行反应。过短特异性差。物设计要点(2)引物3端的碱基般不用A,因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小些。3端防止连续三个C或G引物的GC含量般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含扯不能相差太大。引物设计要点(3)碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续1个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发火结构或 3昭心从而影响引物与模板的复性结合a、发夹结构(Hairpin)自身互补isoC isoG 发夹结构b二聚体(Dimer)两个引物间互补引物1引物25 引物二聚体3S 3 体

3、聚二成形伸延端末丁从下用作的酶,q 3a 卫115 田S 3 二聚体引物设计要点(4)a)引物的5端可以修饰，而3端不可修饰b)引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性引物5端修饰包括加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变缺失突变序列；引入启动子序列等c)引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。在引物的5端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上3 橾l=限制酶识别序列5.s如限制酶识另妇三3双酶切优点：使DNA片段能定向插入亵达载体，防止自连。引物设计要点（5)退火温度高，扩增特异性强：退火温度低，扩培效率高原因是：

4、如果引物碱基数较少，可以适当提商退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4c6c不会影响PCR的产率，但是理想估况下一对引物的退火品度是一样的(2020 江苏卷）如果已知小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示（以EcoRl酶切为例）。诮据图回答 问题：冬染色体DNA1酶切lEcoRI笘：嘉-二二乏一三匕一一一己一混合的DNA片段5 3片段F.DNA连接酶坏状DNA川扩增!laqDNA聚合酌lV测序、分析I 5-3 片段F的完整序列PCR产物(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤田选用的PCR引物必须是（从引物中选择，填编号）f D.序列（虚线处省略了部分核昔酸序列）1 已知5一一计AA从CI认AT如GC怂CiCI1C6A认TG村A-G怂CA什A戍rG叔CCi：灶TA如GC弘CTC品T一3 5 序列3 A-(i)5A.CTATGCGCTCATG.-.3 s-GCAATGCGTAGCCTCT-J 引物5AGAGGCTACGCATTGG3 Q)5TCATGAGCGCATM订叮一3fi 答案：