《农业微生物学》实验指导.doc

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1、农业微生物学实验指导（适用专业：农学、园艺、植物保护专业）黑龙江八一农垦大学植物科技学微生物教研室目 录实验一 油镜的使用与细菌形态观察、染色 1实验二 微生物细胞大小的测定和显微镜直接计数 17实验三 几大类微生物形态及菌落形态观察 23实验四 培养基配制；消毒和灭菌技术 25实验五 土壤中微生物的平板菌落分离、计数与纯化 34实验六 菌肥中有效活菌数的测定 39附录一 实验教学常用染色液 42附录二 实验教学常用培养基 44实验一 油镜的使用与细菌形态观察、染色 油镜的使用及细菌形态观察一、实验目的：学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护的基本知识；学会使用油镜观察细菌的基本形态。二、实验原

2、理 微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜（16mm，10）高倍物镜（4mm，40-45）和油镜（，95-100）三种。油镜常标有黑圈或红圈，它是三者中放大倍数最大的。使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率，与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了（图-1）。利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。因为显微镜的放大效能由其数

3、值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示： 式中 数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力。 （式中：l=光波波长）由上述可知若n值和角越大则NA越大或光波波长越短，则显微镜的分辨力越大（图-2）。一些物质的折射率：水（）、玻璃（）、空气（）、香柏油（）。三、实验器材1、仪器 显微镜；2、材料 细菌三种形态的染色标本和培养12-18h的大肠杆菌。香柏油，二甲苯，擦镜纸,吸水纸等。图1-3 光学显微镜的构造 动螺旋四、操作步骤1、取镜 显微镜是光学

4、精密仪器，使用时应特别小心。从镜箱中取出时，一手握镜臂，一手托镜座，放在实验台上。在使用时要特别小心。使用前首先要熟悉显微镜的结构和性能，检查各部零件是否完全合用，镜身有无尘土，镜头是否清洁。做好必要的清洁和调整工作。显微镜构造见图-32、调节光源 （1） 将低倍物镜旋到镜筒下方，旋转粗调螺旋，使镜头和载物台距离约为厘米左右。 （2） 上升聚光器，使之与载物台表面相距1毫米左右。 （3） 左眼看目镜调节反光镜镜面角度（在天然的光线下观察，一般用平面反光镜；若以灯光为光源，则一般多用凹面反光镜）。开闭光圈，调节光线强弱，直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。 一般染色标本油镜检查，光度宜强，可将

5、光圈开大，聚光器上升到最高，反光镜调至最强；未染色标本，在低倍镜或高倍镜观察时，应适当地缩小光圈，下降聚光器，调节反光镜，使光度减弱，否则光线过强不易观察。3、低倍镜观察 低倍物镜（8或10）视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。操作步骤： （1） 先将标本玻片置于载物台上（注意标本朝上），并将标本部位处于物镜的正下方、转动粗调螺旋，上升载物台使物镜至距标本约厘米处。 （2） 左眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调节螺旋使载物台缓慢上升，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部

6、位。 （3） 移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。4、高倍镜观察 将高倍物镜（40）转至镜筒下方（在转换物镜时，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞），调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野中央，待油镜观察。 5、油镜观察 （1） 用粗调螺旋提起镜筒，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。右手顺时针方向慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并及时从侧面注视使油浸物镜浸入油中，直到几乎与标本接触时为止（注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜

7、头）。 （2） 左眼看目镜，右手反时针方向微微转动粗调螺旋，下降载物台（注意：此时只准下降载物台，不能向上调动），当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。 （3） 如果向上转动粗调螺旋已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。 （4） 观察完毕，下降载物台，取下标本片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头，可用绸布擦净显微镜的金属部件。 （5） 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱

8、中。五、注意事项1、显微镜镜头的保护和保养2、使用显微镜时应据不同的物镜而调节光线3、显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。六、思考题1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？2、使用油镜时为什么必须使用镜头油？3、镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的学习微生物涂片；掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法；进一步熟练掌握显微镜油镜的使用技术。二、实验原理微生物染色的基本原理：是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素如：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素如：正负离子之间的相

9、互吸引等。染色剂 染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1酸性染料 如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。2碱性染料 一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。3中性（复合）染料：如伊红美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。4单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和

10、革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。三、实验器材1、细菌培养物：枯草杆菌（Bacillus subtilis）12-16h的斜面培养物，大肠杆菌（Esch

11、erichia coli）24小时的培养物2、染色液和试剂：结晶紫（附一、3）、卢哥氏碘液（附一、4）、95%酒精、番红（附一、5）、复红（附一、2）、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜四、实验方法1、简单染色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂枯草杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的枯草杆菌浓菌液挑2-3环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文

12、火烘干。（3）固定：手执载玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红或结晶紫或美蓝染色1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液。（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。（7）镜检：先低倍镜观察，再高倍镜观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫染色：将载玻片置于废液缸载玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液

13、染色1分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将载玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色2025s至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加番红复染2-3min。（10）水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦

14、镜头时向一个方向擦拭。看后的染色载玻片用废纸将香柏油擦干净。五、实验作业给出Bacillus subtilis和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。六、注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌

15、转呈阴性反应。七、思考题1.简单染色法中各步骤的注意事项是什么？2.做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？革兰氏染色成败的关键一步是什么？3.当对未知菌进行革兰氏染色时，怎样能证明你的染色技术和结果的正确性？ 细菌的芽胞染色一、实验目的：学习细菌的芽胞染色法二、实验原理：细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而

16、菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。三、实验器材1.活材料：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）。2.染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液（附录一、7）、0.5%蕃红水溶液（附录一、6）。3.器材：小试管（75mm10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子、显微镜等。四、实验方法1.改良的Schaeffer和Fulton氏染色法（1）制备菌液：加12滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取23环的菌体于试管中并充分打

17、匀，制成浓稠的菌液。（2）加染色液：加5%孔雀绿水溶液23滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。（3）加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯），加热1520min。（4）涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干。（5）固定：将涂片通过酒精灯火焰3次。（6）脱色：用水洗直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。（7）复染：加蕃红水溶液染色5min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。（8）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜观察。结果：芽胞呈绿色，芽胞囊和菌体为红色。氏染色法（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。（2）晾干固定：待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过23次。

18、（3）染色： 加染色液：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），然后将涂片放在铜板上，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持15-20min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。 水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 复染：用蕃红液染色5min。（4）水洗、晾干或吸干。（5）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。五、实验作业：绘出所用材料的芽胞和菌体的形态图。六、注意事项1.供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。2.改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规涂

19、片法优越，可优先使用。3.用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次是从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。 细菌的鞭毛染色一、实验目的：学习细菌的鞭毛染色法二、实验原理：细菌的鞭毛极细，直径一般为1020nm，只有用电子显微镜才能观察到。但是，如采用特殊的染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。现推荐以下两种染色法。三、实验器材1.活材料：培养12-16h的水稻

20、黄单胞菌（Xanthomonas oryzae），粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）或假单细胞菌（Pseudomonas sp.）斜面菌种。2.染色液和试剂：硝酸银染色液（附录一、12）、Leifson染色液（见附录一、13）、香柏油、二甲苯。3.器材：载玻片、擦镜纸、吸水纸、记号笔、玻片搁架、镊子、接种环，显微镜。四、实验方法（1）清洗玻片 选择光滑无裂痕的玻片，最好选用新的。为了避免玻片相互重叠，应将玻片插在专用金属架上，然后将玻片置洗衣粉过滤液中（洗衣粉煮沸后用滤纸过滤，以除去粗颗粒），煮沸20min。取出稍冷后用自来水冲洗、晾干，再放入浓洗液中浸泡56天，使用前取出

21、玻片，用自来水冲去残酸，再用蒸馏水洗。将水沥干后，放入95%乙醇中脱水。（2）菌液的制备及制片：菌龄较老的细菌容易失落鞭毛，所以在染色前应将待染细菌在新配制的牛肉膏蛋白胨培养基斜面上（培养基表面湿润，斜面基部含有冷凝水）连续移接3-5代，以增强细菌的运动力。最后一代菌种放恒温箱中培养1216h。然后，用接种环挑取斜面与冷凝水交接处的菌液数环，移至盛有12mL无菌水的试管中，使菌液呈轻度混浊。将该试管放在37恒温箱中静置10min（放置时间不宜太长，否则鞭毛会脱落），让幼龄菌的鞭毛松展开。然后，吸取少量菌液滴在洁净玻片的一端，立即将玻片倾斜，使菌液缓慢地流向另一端，用吸水纸吸去多余的菌液。涂片放

22、空气中自然干燥。用于鞭毛染色的菌体也可用半固体培养基培养。方法是将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中，待凝固后在平板中央点接活化了3-4代的细菌，恒温培养12-16h后，取扩散菌落的边缘制作涂片。（3）染色 滴加A液，染46min。 用蒸馏水充分洗净A液。 用B液冲去残水，再加B液于玻片上，在酒精灯火焰上加热至冒气，约维持0.51min（加热时应随时补充蒸发掉的染料，不可使玻片出现干涸区）。 用蒸馏水洗，自然干燥。（4）镜检：先低倍，再高倍，最后用油镜检查。结果：菌体呈深褐色，鞭毛呈浅褐色。（1）清洗玻片法同1。（2）配制染料 见附录一、13。染料配好后要过滤15-20次后染

23、色效果才好。（3）菌液的制备及涂片 菌液的制备同1。 用记号笔在洁净的玻片上划分34个相等的区域。 放1滴菌液于第一个小区的一端，将玻片倾斜，让菌液流向另一端，并用滤纸吸去多余的菌液。 干燥 在空气中自然干燥。（4）染色 加染色液于第一区，使染料覆盖涂片。隔数分钟后再将染料加入第二区，依此类推（相隔时间可自行决定），其目的是确定最合适的染色时间，而且节约材料。 水洗：在没有倾去染料的情况下，就用蒸馏水轻轻地冲去染料，否则会增加背景的沉淀。干燥：自然干燥。（5）镜检：先低倍观察，再高倍观察，最后再用油镜观察，观察时要多找一些视野，不要企图在1-2个视野中就能看到细菌的鞭毛。结果：菌体和鞭毛均染成

24、红色。五、实验作业：给出鞭毛菌的形态图六、注意事项1.镀银法染色比较容易掌握，但染色液必须每次现配现用，不能存放，比较麻烦。2.Leifson染色法受菌种、菌龄和室温等因素的影响，且染色液须经15-20次过滤，要掌握好染色条件必须经过一些摸索。3.细菌鞭毛极细，很易脱落，在整个操作过程中，必须仔细小心，以防鞭毛脱落。4.染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件。附：细菌的运动性观察一、实验原理细菌是否具有鞭毛是细菌分类鉴定的重要特征之一。采用鞭毛染色法虽能观察到鞭毛的形态、着生位置和数目，但此法既费时又麻烦。如果仅须了解某菌是否有鞭毛，可采用悬滴法或水封片法（即压滴法）直接在光学显微镜下检

25、查活细菌是否具有运动能力，以此来判断细菌是否有鞭毛。此法较快速、简便。悬滴法就是将菌液滴加在洁净的盖玻片中央，在其周边涂上凡士林，然后将它倒盖在有凹槽的载玻片中央，即可放置在普通光学显微镜下观察。水封片法是将菌液滴在普通的载玻片上，然后盖上盖玻片，置显微镜下观察。大多数球菌不生鞭毛，杆菌中有的有鞭毛有的无鞭毛，弧菌和螺菌几乎都有鞭毛。有鞭毛的细菌在幼龄时具有较强的运动力，衰老的细胞鞭毛易脱落，故观察时宜选用幼龄菌体。二、实验器材1.活材料：培养12-16h小时的枯草杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、假单胞菌（Pseudom

26、onas sp.）。2.试剂：香柏油、二甲苯、凡士林等。3.器材：凹载玻片、盖玻片、镊子、接种环、滴管、擦镜纸、显微镜。三、实验方法：1.制备菌液：在幼龄菌斜面上，滴加3-4mL无菌水，制成轻度混浊的菌悬液。2.涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。3.滴加菌液：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘在一起，然后翻转凹玻片，使菌液正好悬在凹槽的中央，再用铅笔或火柴棒轻压盖玻片，使玻片四周边缘闭合，以防菌液干燥。若制水封片，在载玻片上滴加一滴菌

27、液，盖上盖玻片后即可置显微镜下观察。5.镜检：先用低倍镜找到标记，再稍微移动凹玻片即可找到菌滴的边缘，然后将菌液移到视野中央换高倍镜观察。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动），前者在视野下可见细菌自一处游动至他处，而后者仅在原处左右摆动。细菌的运动速度依菌种不同而异，应仔细观察。结果：有鞭毛的枯草杆菌和假单胞菌可看到活跃的运动，而无鞭毛的金黄色葡萄球菌不运动。四、实验作业：绘出所看到的细菌的形态图，并用箭头表示其运动方向。五、注意事项1.检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动。2.

28、制水封片时菌液不可加得太多，过多的菌液会在盖玻片下流动，因而在视野内只见大量的细菌朝一个方向运动，从而影响了对细菌正常运动的观察。3.若使用油镜观察，应在盖玻片上加香柏油一滴。 细菌的荚膜染色一、实验目的：学习细菌的荚膜染色法：二、实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。三、实验器材1.活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus，俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜

29、丰厚。2.染色液和试剂 ：Tyler法染色液：（附录一、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（附录一、2）、黑素（附录一、8）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。 3.器材： 载玻片、玻片搁架， 擦镜纸、显微镜等。四、实验方法推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。1.负染色法：（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（3）染色：在涂面上加复红染色液染色23min。（4）水洗：用水洗去复红染

30、液。（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。结果：背影灰色，菌体红色，荚膜无色透明。2.湿墨水法（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁

31、净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。（3）干燥：空气中自然干燥。（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min，立即倾去甲醇。（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。（6）染色：用甲基紫染12min。（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的

32、面积不宜过大。（2）干燥：在空气中自然干燥。（3）染色：用Tyler染色液染57min。（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加12滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。五、实验作业：绘出Bacillus mucilaginosus的形态图，并注明各部位的名称六、注意事项1.加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。2.应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。采用Tyler法染色时，标本

33、经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO4冲洗。实验二 微生物细胞大小的测定和显微镜直接计数 微生物细胞大小的测定一、实验目的了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。二、实验原理微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺（图2-1）是一块圆形载玻片，在载玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜

34、测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0m（即），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，

35、换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。三、实验器材1活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面菌种或枯草杆菌（Baccillus subtilis）染色标本片。2器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦镜纸。图 2-1目镜测微尺四、实验方法1目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完

36、全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0m，则目镜测微尺上每小格长度为=510m/510m 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度

37、。 2细胞大小的测定 （1） 将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液。 （2） 取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。 （3） 移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定1020个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。（4）同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。五、实验作业：将实验结果填入下列表格表2-1 目镜测微目尺校正结果物镜 目镜测微尺格数 镜台测微尺格

38、数 目镜测微尺校正值（m）1040100表2-2 酵母菌大小测定记录（格） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值长宽表2-3 枯草杆菌大小测定记录（格）细胞数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 平均值长宽结果计算 长（m）长平均格数校正值宽（m）宽平均格数校正值大小表示：宽长m六、注意事项1、当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。2、不能用血球计数板对目镜测微尺在油镜下进行校正时，此时目镜测微尺每格相当于1微米。 显微镜直接计数法一、实验目的 明确血球计数板计数的原理；掌握使用血球计数板进行微生物计数的方法。二、实验原理 测定微生物数量

39、方法很多，通常采用的有显微镜直接计数法和平板计数法。 镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（Petroff Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网（图2-2）。每个方格网共分9大格，其中间的一大格（又称为计数室）常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种

40、：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成（图23）。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为，所以每个计数室（大方格）的体积为3，每个小方格的体积为l4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 图2-2（中间平台分两半，各刻有一个方格

41、网）（中间平台与盖玻片之间有高度为毫米的间隙）图2-3 血球计数板计数网的分区和分格三、实验器材1、 菌种 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌液；2、仪器 显微镜，血球计数板；3、材料 盖玻片，吸水纸，尖嘴滴管。四、操作步骤 1、视待测菌液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。 2、取洁净的血球计数板一块，在计数室上盖上一块盖玻片。 3、将酵母菌液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），使菌液沿两玻片间自行渗入计数室，勿使产生气泡，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌液。也可以将菌液直

42、接滴加在计数室上，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。 4、静置约5分钟，先在低倍镜下找到计数室后，再转换高倍镜观察计数。5、使用血球计数板计数时，由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。如菌体位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。6、凡酵母菌的芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。每个样品重复数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），取其平均值，按下述公式计算出每毫升菌液所含酵

43、母菌细胞数。已知：1cm3体积=10 mm10 mm10 mm= 1000mm3所以：1cm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4106个小方格，即系数K=4106 。因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）系数（K）菌液稀释倍数（d）。7、血球计数板用后，在水龙头上用水柱冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或吹风机吹干，放回盒内。五、注意事项1、加酵母菌液时，量不应过多，不能产生气泡。2、由于酵母菌菌体无色透明，计数观察时应仔细调节光线。或者用吕氏碱性美蓝染液处理酵母菌液。六、思考题1、为什么目镜测微尺必须用镜台测微尺来校

44、正？2、在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？实验三 几大类微生物形态及菌落形态观察细菌、放线菌、酵母菌及霉菌菌体形态的观察一、实验目的：学习观察细菌、放线菌、酵母菌和霉菌形态的基本方法；加深理解细菌、放线菌、酵母菌和真菌的形态特征。二、实验原理放线菌和霉菌都可产生复杂分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝长到一定阶段分化产生孢子丝（放线菌）或繁殖菌丝。由繁殖菌丝产生孢子。放线菌和霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类放线菌和霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几十倍。因此，用低倍显微镜即可观察。三、实验材料1各种真菌、

45、细菌和放线菌示范片。2显微镜、载玻片、接种环、酒精灯等。四、实验步骤1. 细菌个体形态观察：观察细菌三型标本片。2. 观察曲霉、青霉、毛霉和根霉的标本片。3. 观察酵母菌的菌体形态：取酵母菌培养液一环制成酵母水浸片，静止一会置于显微镜下观察酵母菌的形态及其出芽情况。观察标本片。4放线菌个体形态观察：观察放线菌标本片。五、作业1. 绘出曲霉、青霉、毛霉和根霉的形态。2. 绘出酵母菌菌体的形状，并注意其出芽情况。、微生物菌落形态观察一、实验原理菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。二、实验器材1、菌种 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，酵母等；土壤和菌肥中微生物分离的菌落观察。2、培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马丁氏培养基；3、材料 无菌平皿，接种环（针），三、操作步骤1、制备菌落平板 分别用上述不同培养基制成平板，然后用上述的细菌、放线菌、酵母菌以划线法制成已知菌平板，而霉菌则用点种法（一点或三点均可）制成已