赖氨酸发酵工艺研究指导书.docx

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1、赖氨酸的发酵调控争辩一、试验目的1、 了解赖氨酸发酵常用的发酵菌种。2、 把握 L-赖氨酸发酵的工艺把握过程和方法。3、 能娴熟运用发酵过程的根本原理，依据试验的不同要求，正确的设计试验方案，并依据试验方案进展试验争辩二、试验原理天冬氨酸天冬氨酰磷酸苏 氨 酸与 赖 氨酸 的 协同 反 馈抑 制 作天冬氨酸半醛高丝氨酸脱氢酶用双氢吡啶羧酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸赖氨酸赖氨酸的生产方法有水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。直接发酵法合成的赖氨酸是一种次级代谢产物。微生物合成赖氨酸是诱导物的诱导调整、自身产物的反响调整、自身产物的分解调整、以及细胞膜透性的调整等次级代谢调整综合作用的结果。谷氨

2、酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调整作用如图 1 所示。异亮氨酸图 1 谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调整作用1三、材料与分析方法1、 菌种谷氨酸棒杆菌编号 10065，中国微生物菌种保藏治理中心。2、 培育基1斜面培育基：牛肉膏 1.1%，蛋白胨 1.0%，葡萄糖 0.5%，NaCl 0.5%， 琼脂 0.2%，pH7.0，在 0.1Mpa 压力下灭菌 20min。2种子培育基：糖蜜 2.0%，豆饼水解液 0.5%，(NH4)2SO4 0.4%，CaCO30.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.04%，pH7.0,，于 250mL 三角瓶内装 25mL 种子培育基, 在 0.1Mpa

3、 压力下灭菌 20min。3发酵培育基：糖蜜 20%，豆饼水解液 1.0%，玉米浆氮源0.6%，(NH4)2 SO4 2%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.05%，FeSO4 0.2%，MnSO4 0.2%，pH7.0，于250mL 三角瓶装液 25mL 发酵液，在 0.1Mpa 压力灭菌 20min。3、分析方法（1） 丝氨酸的测定承受变色酸-分光光度法测定见附录 1。（2） 赖氨酸的测定2发酵液中赖氨酸含量的测定承受茚三酮比色法，并加以改进。吸取发酵液4mL, 6000r/min 离心 10min 去菌体及杂质。取上清液 2mL，加茚三酮试剂A 液： 茚三酮 1.25g 溶于 94

4、mL 乙二醇甲醚中；B 液：CuCl 2H2O 1.97g 溶于 32mL0.1mol/L 柠檬酸溶液中；将 A、B 两液混合，用蒸馏水定容到 250mL4mL， 混合，在沸水浴加热 20min，冷却后测定 475nm 处的吸光度值，通过查赖氨酸标准曲线得知发酵液中赖氨酸的浓度。（3） 菌体形态观看、菌种培育特性和菌种主要生理生化特性检查参照工业微生物试验技术手册的方法.。（4） 高丝氨酸脱氢酶活力的测定从图 1 可知，天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的作用下可以转化为丝氨酸， 因此，本试验以肯定反响条件下，单位时间内生成的丝氨酸的量所需的酶作为一个酶活力单位U1U=1ug/min。粗酶液的制备取

5、 5ml 发酵液 5500g 离心 15min，用 pH 7.5 的 0.25mmol 的 Tris-HCL 缓冲液洗涤两次，超声波裂开 10min，10000g 离心 15min 得上清液即为粗酶提取液；取粗酶液和 1.0mg/ml 的天冬氨酸半醛按 1:1 的比例混合，32水浴保温5min，转入 100的水浴终止反响 1min，取 1ml 按丝氨酸的含量测定法进展测定。关于酶与底物反响的量要进展试验调整，以上仅供参考。四、试验方法与步骤1、将活化的斜面培育菌接种于种子培育基中，置于往复摇床上 30振荡培育24h，得到种子培育物。2、将种子培育物调整为 64107 个菌体/mL 的种子培育液

6、。按 110 的接种量将种子培育液接种于发酵培育基中，在 302、pH7.07.2 条件下发酵 72h。五、结果与分析1、该发酵菌种的生长特性，绘制菌种生长及代谢产物形成与培育时间的特征曲线；2、构建该菌种在最正确发酵条件下的细胞生长、底物利用和产物形成动力学模型；3、找出该菌株发酵生产赖氨酸的主要影响因素，确定调控措施，确定其最正确发酵条件。附录1、标准曲线的制作丝氨酸含量的测定方法分别周密吸取 1.0mg/mL 的丝氨酸标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于 10 mL 刻度试管中，滴一滴甲基红试液取 0.1g 甲基红溶于 100mL95%乙醇中，加 1.0molL1

7、 的 NaOH 溶液使之刚呈碱性，再加 0.075molL -1 NaIO4 溶液1.0 mL；10 min 后，滴加 10%三氯乙酸溶液使呈酸性，再参加 10%的 NaHSO3溶液 1.0 mL 并补加水至 10.0 mL，摇匀，取 2.0 mL 于 10mL 具塞离心管中，加变色酸试剂取变色酸 50 mg 溶于 100 mL 体积分数 75%硫酸中2.0 mL，加塞混匀后于沸水浴中保温 30min，取出，冷却至室温，加半饱和硫脲溶液(在 20 度温度下，称取超过 137 克的硫脲，参加 1000ml 蒸馏水中，充分搅拌，使其充分溶解。过滤后去除滤渣，所得到的溶液即为饱和溶液)0.5mL，摇

8、匀。用分光光度计测量反响产物在波长 570nm 处的吸光度。将吸光度对浓度进展直线回归，得丝氨酸标准曲线方程。2、样品测定将待测氨基酸样品溶液适当稀释后，准确吸取肯定体积的样品稀释液，依据标准曲线绘制的方法测定吸光度，从标准曲线上查得丝氨酸的质量浓度。底物复原糖含量的测定1 试验原理在 NaOH 和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸DNS与复原糖共热后被复原生成氨基化合物。在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色，在 540nm 波特长有最大吸取， 在肯定的浓度范围内，复原糖的量与光吸取值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。2 试剂3,5二硝基水杨酸DNS试剂：称取6.5g DNS

9、 溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入 1000mL 容量瓶中，参加 2mol/L 氢氧化钠溶液 325mL，再参加 45g 丙三醇， 摇匀，冷却后定容至 1000mL。葡萄糖标准溶液：准确称取枯燥恒重的葡萄糖 200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至 100mL，即含葡萄糖为 2.0mg/mL。3 操作方法葡萄糖标准曲线制作取 6 支 1. 5 cmm1.5cm 试管，按下表参加 2.0mg/mL 葡萄糖标准液和蒸馏水。001010.20.80.420.40.60.830.60.41.240.80.21.65102管号葡萄糖标准液mL蒸馏水(mL)葡萄糖含量(mg/mL)A540在上述试管中

10、分别参加 DNS 试剂 2.0mL，于沸水浴中加热 2min 进展显色，取出后用流淌水快速冷却，各参加蒸馏水 9.0mL，摇匀，在 540nm 波特长测定光吸取值。以葡萄糖含量mg/mL为横坐标，光吸取值为纵坐标，绘制标准曲线。4 样品测定将待测复原糖样品溶液适当稀释后，准确吸取肯定体积的样品稀释液，依据标准曲线绘制的方法测定吸光度，从标准曲线上查得复原糖的质量浓度。谷氨酸棒杆菌菌体生长量的测定每隔肯定时间取样,测定菌液的光密度值(OD620) ，已未接种的培育基作为参比溶液，绘制菌体生长状况曲线。种子培育基细菌计数挑取已活化的单菌落接种于种子培育基中，30，120r/min 摇床振荡过液培育

11、，或许 18 小时；培育过程中取菌液测量菌体数，测量方法如下：在白纸上画 1cm 的正方形，将玻片置于其上；用微量注射器去 10ul 的菌液，用接种针涂抹均匀，保持在正方形区域内，待干；置于试管架上，在水蒸气上固定 5min，待干；滴一滴美蓝染液染色 2min，用滤纸戏去多余的染液，待干；用水洗去多余的染液，待干，并用油镜镜检，记录 3050 个视野，细菌数=3050 个视野细菌数/3050*500000,细菌数的数量级在 107108 即可赖氨酸的发酵调控争辩的可能争辩点1） 不同的碳氮源对赖氨酸发酵的影响；2） 转变细胞膜的通透性如添加生物素，钙离子，以及一些金属离子如锰离子，镁离子等对赖氨酸产量的影响；3） 查找对高丝氨酸脱氢酶酶活的影响的因素从而对赖氨酸发酵的影响；4） 添加合成途径的中间代谢物对赖氨酸的影响如添加天冬氨酸半醛、异亮氨酸，蛋氨酸构造类似物甲基蛋氨酸，酸酸构造类似物 -氨基-羟基戊酸等；