巴戟天对大鼠骨髓基质细胞增殖、成骨分化及Cbfal基因表达影响的研究开题报告.doc

《巴戟天对大鼠骨髓基质细胞增殖、成骨分化及Cbfal基因表达影响的研究开题报告.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《巴戟天对大鼠骨髓基质细胞增殖、成骨分化及Cbfal基因表达影响的研究开题报告.doc（15页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、福 建 中 医 学 院攻读博士学位研究生课题研究计划系（院、部）：骨伤系 教 研 室：骨伤教研室 专 业：中医骨伤科学研 究 方 向：骨折愈合 导 师 姓 名：王和鸣 教授 课题研究起止时间：2003年9月1日至2005年5月1日 研究生签名：王力 填表时间：2003年12月1日说明一、本计划由研究生本人在向导师小组作过开题报告后填写，一式二份，最后经系（院、部）批准后，一份留系（院、部）一份送研究生部存档。二、开题报告一般要求在第三学期进行，最迟不得超过第四学期。三、计划批准后非经同样手续不得随意更改。四、在课题执行过程中导师检查两次。检查情况及变动情况应记录在表内。研究课题名称：巴戟天对大

2、鼠骨髓基质细胞增殖、成骨分化及Cbfal基因表达影响的研究研究课题的目的，课题的理论与实际意义，国内外研究情况介绍课题研究目的：通过巴戟天水提物、巴戟天醇提物的含药血清对体外培养的骨髓基质细胞增殖、诱导骨髓基质细胞向成骨分化及Cbfal mRNA的表达的影响的研究，探讨巴戟天促进成骨的有效部位，从分子生物学水平研究巴戟天促进成骨作用的机制，同时建立中药血清药理学方法培养骨髓基质细胞的模型，阐明补肾强骨类中药疗效作用机制，为中药促进骨折愈合，治疗骨折迟缓愈合、不愈合以及中医药在骨组织修复工程中的应用等提供科学依据，也为新药开发、中医药现代化研究提供科学的理论依据。课题的理论、实际意义及国内外研究

3、介绍：骨折延迟愈合、不愈合和骨缺损患者临床并不少见，且治疗起来非常棘手，均属于骨伤科疑难病症，从目前的临床和研究来看，骨组织工程和中医药是最有希望取得突破的方法。由于某种因素如外伤、感染、肿瘤等而使骨丧失一些骨质，形成较大的间隙，称为骨缺损。绝大多数骨缺损都难以愈合，最后形成骨不连。由于缺损间隙大，成骨细胞难以爬过间隙而不能发生正常的愈合过程，仅由纤维组织填充。而通过组织工程学方法来治疗骨缺损是目前研究的热点之一。它不仅可以免除自身骨移植的供区损伤，也可避免同种异体移植供体来源有限和不可避免的免疫排斥反应。骨折愈合是复杂的组织学，生物学，内分泌学及生物力学的动态过程。骨折的生物学过程及其伴随的

4、组织学变化已得到公认。虽然学者们对此过程的分期不尽相同，但并无实质上的差异。综合各种分期方法,骨折愈合从组织学上可概括为血肿和炎症期、原始骨痂反应期、软骨形成期和骨形成改建期等4个阶段1,2。骨折修复过程包括以下三个方面1：(1)骨折部位骨祖细胞的募集；骨折后，骨折端内外膜成骨细胞出现增殖，但它们并不直接参与骨端的连接。骨折间隙内来自髓腔的多潜能细胞及来自邻近软组织的原始成纤维细胞的聚集和增殖，在适当刺激后即变成具有成骨能力的骨祖细胞，积极参与骨联接。因此骨折后的炎症反映，骨折端及其邻近软组织的良好血供，对骨折愈合是十分重要的。(2)调控诱骨：人们已能在骨折修复过程中的不同时期和不同部位检测到

5、多种具有诱导成骨作用的生长因子。它们能促进细胞增殖，分化及基质合成，对骨折的启动，发育调控及塑形均起重要作用。骨折血肿内炎症细胞，巨噬细胞及血小板均可释放不同的生长因子；血管内皮细胞，成纤维细胞，成软骨细胞，成骨细胞，以及它们的基质均为各种生长因子的来源3。（3）骨传导：选用合适材料桥接于骨端。上述任何一个环节存在缺陷，有可能出现骨折的延迟愈合和不愈合. 骨愈合的机理非常复杂，它不同于其他组织器官的愈合主要在于参与骨愈合的细胞较其他组织器官多不同愈合阶段有不同的细胞参与同时细胞外多种蛋白在此过程中也起重要作用。近年来，分子生物学作为从分子水平阐明生命本质的新兴边缘学科在骨科基础研究领域日益得到

6、重视并受到广泛应用。种子细胞的选择一直是困扰骨组织工程进展的难题之一，虽然已有研究利用骨外膜成骨细胞5、松质骨来源的成骨细胞5、软骨细胞6作为种子细胞，但这些细胞已接近成熟，体外培养增殖力弱，而且取材不方便，供体局部损伤大，来源有限。可是来源于骨髓的BMSCs在体外培养、扩增并诱导后有很强的成骨能力，且容易分离，来源广泛，应用安全方便，所以其正作为骨组织工程中首选的种子细胞日益受到重视7、8。存在于骨髓中的含有骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在不同的诱导条件下，能向成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等中胚层组织细胞分化，所以近年来又将其称为

7、“间充质干细胞”或“骨源性干细胞” 9。Reddi等10研究证实：成骨细胞前体骨祖细胞有两种类型，一是定向骨祖细胞(Determined Osteogenic Precursor Cell,DOPC),其具有干细胞特性，不需要外源性诱导物就能自动分化成骨，它仅在骨髓中及骨表面发现，由BMSCs转化而成；二是诱导性骨祖细胞(Inducible Osteogenic Precursor Cell,IOPC),其是一种未分化的间叶细胞，存在于所有的结缔组织中，也存在于骨髓中，此类细胞不能自发地形成骨组织，必须在骨形态蛋白（BMP）等诱导物作用下才能转化为成骨细胞。BMSCs是唯一含有丰富的DOPC和

8、IOPC的组织。可以看出，诱导物是促进BMSCs成骨分化及提高BMSCs成骨能力的重要影响因素。近年来，对各种诱导物的作用进行了大量研究，包括有糖皮质激素、维生素C、-甘油磷酸钠（-GP）、骨形态发生蛋白（BMP）及骨生长因子等等。维生素C能促进体外培养细胞合成胶原，形成钙化，也能调节ATP及ALP活性，并影响其合成。Chung等11认为：体外成骨细胞骨化必须有-甘油磷酸盐的参与，其可作为ALP的底物刺激钙化，但在悬液中的浓度不能超过2mM，否则形成不了钙的沉积；Maniatopoulos等12也认为-GP为细胞提供磷酸根成分，促进生理性钙盐沉积及钙化。地塞米松（DEX）能促进BMSCs向成骨

9、细胞转化，但同时也抑制了BMSCs的增殖13。DEX是BMSCs体外成骨的必须成分，究其原因，这可能是由于骨细胞是糖皮质激素的靶细胞14。Jaisawl15等研究发现当培养基中含有成骨添加剂（DEX、抗坏血酸和(-磷酸甘油)时，BMSCs的成骨能力明显增强。Lecklin16等更是认为培养条件中必须有DEX、转化生长因子等因素存在,才能促使其大量向骨形成方向转化。TGF-1能诱导BMSCs向成骨方向分化及促进成骨细胞的增殖17。国内学者易诚青等18的研究表明：TGF-1基因转染对BMSCs有明确的促成骨作用。BMP具有较强的骨诱导活性，能够启动BMSCs的成骨过程，能使诱导性骨细胞向确定性骨细

10、胞转化。BMPs现有15种以上，以BMP2的作用最强。徐小良等19用腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2(AdvhBMP2)基因转染的BMSCs能诱导本身和周围的间充质干细胞向成骨细胞分化并成骨，且符合骨愈合的需要。总之，BMSCs在骨组织工程领域的研究已取得很大进展，为骨组织的修复和重建拓展了全新的研究和治疗思路，具有广阔的应用前景。核心结合子a（core binding factor a,Cbfa）,又称多瘤病毒增强子结合蛋白（polymavirus enhancer binding protein,，PEBP）或急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)因子，属于R

11、UNT结构域基因家族。它包括Cbfal、2和3，其中Cbfal仅表达于骨、胸腺和睾丸。目前的研究表明Cbfal具有如下特点：（1）Cbfal是骨形成的关键基因,又是成骨细胞(0B)分化和功能的中心调控因子，是0B分化最早且最具特异性的标志，决定着成骨细胞的发生与分化， Cbfal在成骨部位的高表达以及在骨形成过程中的重要作用，提示它是成骨分化不可缺少的转录因子。基因破除实验证实cbfal缺陷的纯合鼠无骨的形成，杂合鼠则出现成骨细胞功能的下降。（2）Cbfa1能稳定地调节成骨细胞所有主要基因的表达。Cbfal作为成骨分化关键性的转录因子，能在非成骨细胞或成骨前体细胞上调成骨分化相关基因的表达，使

12、其向成骨细胞分化20。成骨细胞又称为骨形成细胞，由具备多向分化潜能的间充质细胞、前成骨细胞分化而来，一旦完成终末分化，分泌产生各种细胞外基质蛋白，并控制骨基质的矿化过程。Cbfal可与骨钙素基因(Bgp)的启动于区0B特异性的顺式作用元件0SE(osteoblastspecificcis-acting element)2结合，是0B分化所必需的。Cbfal除对成骨细胞的发育和分化有作用之外，还对骨基质的沉积率有调节作用21。（3）Cbfa1表达的调节过程可成为骨形成新药的目的靶。细胞分化并不是最后目的，成骨细胞进行分化之后，必须完成它们的功能，细胞外基质沉积和逐渐矿化。cbfal的生物学特征提

13、示它的功能不仅限于发育和分化。首先，cbfal在出生后及整个成骨细胞分化阶段都保持着表达；其次，Cbfal是骨钙素的主要调节因子，骨钙素基因在胚胎发育处于静止状态，而在成熟的成骨细胞是非常特异的表型。这两个特点使cbfal能在决定这些细胞的命运及保持它们的功能方面起作用。转基因研究发现，在I型胶原蛋白，骨桥素、BSP和骨钙素基因的启动子区域Cbfal能与之结合的位点，直接调节这些基因的表达。总之，这些涉及到cbfal表达和调节的多个环节，可能成为骨形成新药研究的作用靶点22。中药的多位点、多环节的综合作用方式正好适合这种需求，对于中药促进成骨及骨愈合机制的研究来说，这有可能是突破口之一。祖国医

14、学理论认为:肾主骨，藏精，骨的愈合、生长有赖精血的充养，正如黄帝内经曰：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也，其充在骨。”、“肾生骨髓”、“肾之合骨也”。中医临床已充分证实使用中药补肾益精能使骨愈合加快，治疗骨折迟缓愈合、不愈合效果明显。巴戟天（学名Morinda officinalis）始载于神农本草经，以后历代本草均有记载，系茜草科巴戟天属，南亚热带雨林下的多年生常绿藤本植物，是我国四大南药之一，为名贵中药材，主产于福建、广东、广西等地，其中福建省南靖县和溪乡和永安县湖山乡等雨林中野生巴戟天资源丰富，品种繁多。巴戟天以根部入药，其气味辛、甘，性微温，本经记载：“主阳痿不起，强筋骨，安五脏，补中

15、益气增志”；本草备要载之“补肾益精散风湿，治风气脚气水肿”。其具有补肾阳，强筋骨，祛风湿，益中气之功效，中医用于治疗虚劳内伤，腰膝酸痛，梦遗滑精，阳痿不起，寒湿痹痛，骨折迟缓愈合、不愈合等症。据现代药理研究23，巴戟天的化学成分复杂，现已分离得到11类化学物及24种无机元素，包括有糖类（多糖、单糖等）、蒽醌类化合物（大黄素甲醚、甲基异茜草1甲醚3醋酸脂等）、脂类（谷甾醇等）、氨基酸（11种游离氨基酸、17种水解氨基酸）、黄酮类化合物、有机酸类（棕榈酸等）、多种甙类（水晶兰甙、四乙酰车叶草甙等）、维生素C、无机元素（24种微量元素等）等成分，其中巴戟天水提物中含有糖类、维生素C、氨基酸等24，巴

16、戟天醇提物中含有谷甾醇、蒽醌类化合物、黄酮、水晶兰甙等25、26、27。中药血清药理学最初由日本学者田代真一在1984年提出28，它是指将中药或中药复方经口灌服动物一定时间后采取血液、分离血清，用此含有药物成分的血清进行体外实验的一种方法学。中药血清药理学提供了利用现代化手段来研究中医药，从细胞、分子、基因水平研究中药的作用与其机理的方法，并有助于中药化学成分研究及中药药动学研究的深入，为中药与西药的研究在实验方法上找到了结合点。它既具有体外实验条件可控性强、药物效应易于检测，便于从细胞生物学和分子生物学来角度入手则可深入揭示药物作用机理，又能够防止中药组制剂本身的理化性质对实验的干扰，还能反

17、映中药在胃肠道消化吸收，再经生物转化，最后产生药理效应的真实过程，其原有成分或在体内转化为活性成分，或代谢后失活，或没有被吸收入体内，或通过第二信使而间接起作用都可以通过血清药理学反映出来，理论上更具备科学性、真实性29。本课题主要通过血清药理学的方法来研究巴戟天对体外培养的SD大鼠骨髓基质细胞的生物学性状的影响，探讨巴戟天促进成骨及骨愈合的机制以及中药血清药理学方法在分子生物学中的应用。目前从分子生物学水平对中药疗效及作用机理的研究还比较少，特别是中药对组织工程的影响还有大量工作要做，中药对BMSCs生物学行为影响的研究仅偶见报道30、31。我们采用含中药巴戟天不同成分的血清体外培养大鼠BM

18、SCs，观察巴戟天主要成分对大鼠BMSCs增殖、诱导BMSCs的成骨分化及Cbfal的表达的影响，以探讨中药血清体外培养BMSCs模型的建立，从分子生物学水平探讨补肾强骨类中药促进成骨的机制，为中药促进骨折愈合，治疗骨折迟缓愈合、不愈合以及中药在骨组织修复工程中的应用等提供科学依据，也为新药开发、中医药现代化研究提供科学的理论依据。参考文献1Comell CN，Lane JM. Newest factors in fracture healing. Clin Orthop, 1992： 277：297.2. Frost HM The biology of fracture healling.

19、An overview for clinicians Part 1Clin Orthop，1989；248 ：2832933 Mundy GR.Regulation of bone formation by bone morphogenetic proteins and other growth fractors.Clin Orthop,1996,324:25. 4 Vacanti CA, Kim W, Upton J, et al. Tissue-engineered growth of bone and cartilage. J Transplant Proc.1993;25:101910

20、21.5 Beley CT, Doherty MJ,Haankey DP, et al. The culture of human osteoblasts upon bone graft substitute. Bone , 1993;14:661666.6 Kazuhito I, Yakayuki M, Hiroshi N, Repair of bone defect with cultured chondrocytes bound to hydroxyapatite. Clin Orthop. 1993;(288):287293.7 Herbertson A, Aubin JE, Cell

21、 sorting enriches osteogenic populations in rat bone marrow strmal cell culture. Bone, 1997;21:495-5008 Pittenger MF, Mackay Am, Beck SC, Multilineage potenial of adult human mesenchymal stem cell. Science, 1999; 5:143-1479 Minguell JJ, Erices A, Conget P, Mesenchymal stem cells. J. Exp Biol Med,200

22、1;226(6):50752010 Reddi AH. Bone morphogenetic proteins.bone marrow stroml cell,and mesenchymal stem cells,Maureen owen revisited.Clin Orthop.1995;313:115.11 Chung CH, Golub EE, Forbe E, et al, Mcchanism of action of -glycerophosphate on bone cell.mineralization. Calaif Tissue Int ,1992;51(4):305-31

23、112 Maniatopoulos C, Sodek J, Melcher AH, et al, Bone formation in vitro by stromal cells obtain from bone marrow of young adult rats.Tissue kes,1988;256:317-32513 Kamalia N, McCulloch CA, Tenebaum HC, et al, Dexamethasone recruitment of selfrenewing osteoprogenitor cells in chick bone marrow stroma

24、l celltures. Blood,1992;79:320-32614 Su-Li Cheng, Joseph W,Leonard R, et al, Differentiation of human bone marrow osteogenic stromal cells in vitro:Induction of the osteoblast phenotype by dexamthasore. J.Emdocrinology,1994;134:277-28615 Jaisawl N, HaynEsworth SF, Caplan AI, et al, Osteogenic differ

25、entiation of purified,culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro.J.all Biochcm,1997;64:29516 Locklin RM, Willianison MC, Beresford JN, et al, In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells.Clin orthop,1995;313(4):27-3517 Cornell CN, Lane JM, Newect facto

26、rs in fracture healing. Clin orthop 1992;277:297-31118 易诚青，郑启新，杜靖远,等. 转化生长因子1基因转染骨髓基质细胞的体外成骨研究 中华创伤杂志 2002;18（3）：139-14319 徐小良，戴克戎，汤亭亭，等。腺病毒介导的人骨形态发生蛋白2基因修复兔桡骨缺损。中华创伤杂志 2002;18（11）：677-68020 Ducy P,Zhang r,Geoffroy v,et al.Osf2/Cbfa1:a transcriptional activator of osteoblast differentiationJ.Cell,19

27、97,89(5):74721 Hoshi K,Komori T,Ozawa H.Morphological characterization of skeletal cell in Cbfal-deficient mice. Bone,1999,25:639-651.22 Ziros PG,Gil AP,Georgakopoulos T,et al.The bone-specific transcriptional regulator Cbfal is a target of mechanical signals in osteoblastic cellsJ. Biol Chem,2002，2

28、77：239372394123 王卫平。 巴戟天化学成分和药理作用研究概况。时珍国医药，2000，11（7）：665666。24 李赛。中药巴戟天化学成分的研究。中成药，1988，10：3334。25 周法兴，文洁，马燕。巴戟天的化学成分研究。中药通报，1986，11（9）：4243。26 夏桂兰，赵宝东，赵春玉。巴戟天对小鼠抗疲劳的实验研究。中国病理生理杂志，1998，14（2）:183-186.27 陈玉武，薛智。巴戟天化学成分研究。中药通报，1987，12（10）：3738。28 田代真一。由来培养细胞用汉方药理学研究系开发。和汉医药学会志，1985，2：10610729 张群豪，陈可冀

29、血清药理学在中药及复方研究中应用的评价J中国中西医结合杂志，1996，16(3)：13130 贾延幼，杨于嘉，周燕，等。黄芬甙诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化的研究J中华医学杂志，2002，82（19）：11371141。31 刘金保，董晓先，董燕湘，等。当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞J广东医学，2003，24（5）：466468主要研究内容1、 巴戟天水提物、巴戟天醇提物制备；2、 含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清的制备；3、 MSCs的分离与培养；4、 含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清对BMSCs增殖的影响；5、 含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清对BMSCs成骨分化的影响；6

30、、 含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清对BMSCs成骨分化过程中Cbfal基因表达的影响；主要研究方法1、 巴戟天水提物、巴戟天醇提物制备；a) 巴戟天水提取物的制备：巴戟天产地福建，粉碎后加双蒸水8倍，浸泡2h，煮沸1h，收集药液，再加双蒸水6倍，煮沸1h，收集药液，再加双蒸水，煮沸1h，合并三次药液，以3000rmin离心30min，取上清，4冰箱保存。b) 巴戟天醇提取物的制备 取药物粉碎，以95乙醇回流提取三次，每次1h，回收乙醇至尽，浸膏备用。4冰箱保存。2、 含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清的制备；a) 2天组：用药剂量相当于临床等效剂量，(根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表

31、”计算)。对照组以等量的生理盐水以获得空白对照血清，一日剂量分2次服，第2天1次服用全天剂量，采血前禁食12小时，末次给药1小时后采血。以3000rmin离心15min，分离血清，56水浴，30分钟灭活，20冰箱保存备用。b) 4天组：用药剂量相当于临床等效剂量，(根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算)。对照组以等量的生理盐水以获得空白对照血清，一日剂量分2次服，连续给药3天，第4天1次服用全天剂量，采血前禁食12小时，末次给药1、2、3小时后采血，分别装瓶（供按采血时间分组对照：1小时组、2小时组、3小时组）。其余同两天组。c) 6天组：用药剂量相当于临床等效剂量，(根据“人和动

32、物体表面积折算的等效剂量比率表”计算)。对照组以等量的生理盐水以获得空白对照血清，一日剂量分2次服，连续给药5天，第6天1次服用全天剂量，采血前禁食12小时，末次给药1小时后采血。其余同两天组。d) 高剂量组：用药剂量相当于2倍于临床等效剂量；e) 等效量组：用药剂量相当于临床等效剂量；f) 低剂量组：用药剂量相当于0.5倍于临床等效剂量；3、 MSCs的分离与培养；4、 含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清对BMSCs增殖的影响；a) MTT法检测；b) FCM检测；c) 确立含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清量效关系；d) 确立含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清时效关系。5、 含巴戟天水提物、巴戟

33、天醇提物血清对BMSCs成骨分化的影响；a) ALP染色（Gomori钙鈷法）；b) 矿化结节染色(茜素红法)；c) I型胶原染色(Van Gieson 苦味酸酸性品红法)d) I型胶原免疫组化观察；e) BGP含量的测定；f) ALP活性比的测定；g) 透射电镜观察；h) 倒置相差显微镜;i) HE染色。6、 含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清对Cbfal基因表达的影响；运用RT-PCR法观察BMSCs成骨分化过程Cbfal mRNA的表达及含巴戟天水提物、巴戟天醇提物血清对Cbfal基因表达的影响。 SD大鼠36只(每组12只)技术路线示意图（一、含药血清的制备及巴戟天对BMSCs增殖的影响

34、）：生理盐水组巴戟天醇提物组巴戟天水提物组（）灌 胃各 组 二 次 分 组（每组4只）按灌胃剂量分组按取血时间分组按灌胃时间分组低剂量组等效量组高剂量组3小时组2小时组1小时组6天组4天组2天组取 血制备含巴戟天水提物血清、巴戟天醇提物血清、生理盐水组血清I型胶原免疫组化倒置相差显微镜5%含药血清ALP染色功能鉴定形态学鉴定10%含药血清20%含药血清BMSCs的分离、培养、鉴定透射电镜FCMMTT矿化结节染色 SPSS11.0统计软件分析I型胶原染色建立含巴戟天血清培养BMSCs的模型，评价巴戟天对BMSCs增殖的影响。(二、巴戟天对骨髓基质细胞成骨分化及Cbfal mRNA的表达的影响)S

35、D大鼠120只（生理盐水组、水提物组、醇提物组各40只），制备血清）诱导成骨剂 组含巴戟天醇提物血清诱导成骨剂组含巴戟天水提物血清诱导成骨剂组含巴戟天醇提物血清组含巴戟天水提物血清组生理盐水组取最佳时效与量效制备血清、培养BMSCs 各组按时间点检测HE染色、倒置相差显微镜、透射电镜等形态学观察。6D9D15D12D3D检测指标形态学观察Cbfal mRNA的测定定量分析HE染色透射电镜BGP含量的测定ALP活性的测定倒置相差显微镜Cbfal mRNA的表达Cbfal mRNA的相对表达量SPSS11.0等统计软件分析结论研究进度及具体安排总进度：2003年9月2005年5月具体进度：2003

36、年9月2003年12月文献检索，实验设计；2004年1月2004年12月购买试剂，细胞培养，完成各项检测，收集数据；2005年1月2005年5月再次文献检索，实验资料整理，撰写论文，准备答辩。预期结果以论文形式发表通过巴戟天对大鼠骨髓基质细胞增殖、成骨分化及Cbfal基因表达影响的实验研究，确立含药血清体外培养大鼠BMSCs的模型，揭示巴戟天水提物或巴戟天醇提物可能通过促进骨髓基质细胞增殖、向成骨细胞分化及使此过程中的Cbfal基因表达加强，从而促进成骨，有利于骨愈合、骨修复, 为中药促进骨折愈合，治疗骨折迟缓愈合、不愈合以及中医药在骨组织修复工程中的应用等提供科学依据，也为新药开发、中医药现

37、代化研究提供科学的理论依据。完成课题的条件协助导师具体指导的人员配备李楠 博士主要仪器设备情况AGl04电子分析天平(德国MTTLERTCLEDO);690酸度计(德国BECKMAN);SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);85-1l恒温磁力搅拌器 （常州国华电器有限公司）；LDZX-40H全自动压力灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂）；TGL-16C水平离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);1000ml反复用过滤装置、手动真空泵(美国NalGene);GBB16二氧化碳培养箱(德国Heraeus);SW-CJ-2FD净化工作台(苏州安泰空气技

38、术公司);ZW-A微型振荡器(常州国华电器有限公司);ELX808酶联免疫检测仪(美国BIO-TEK);MDF-U4086S4086S超低温冰箱(日本SANYO);FJ2008Ps 免疫计数仪 (西安262厂);DU650 紫外分光光度计(美国BECKMAN);9600 基因扩增仪(美国PE生物系统公司);DYCP-32 琼脂糖浆水平电泳槽(北京六一仪器厂);GEL DOC 2000凝胶成像系统(美国BIORAD);MILLI-Q Biocel 超纯水装置(美国MILLIPORE);IX70 倒置式系统相差显微镜(日本OLYMPUS);FACSCAN 流式细胞仪(美国BECTON DICKIS

39、ON);64R 低温高速离心机(美国BECKMAN),等等。实验动物情况通过福建中医学院动物实验中心向上海斯莱特动物有限公司购买SD大鼠100只。药物试剂等来源情况 -MEM（HyClone）、新生牛血清（NCS, HyClone）、青链霉素溶液（HyClone）、HEPES(上海生工)、胰蛋白酶（1：250，AMRESCO）、噻唑蓝（MTT, AMRESCO）、ALP测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、BGP放免分析试剂盒（中国原子能科学研究院）、Ttizol Reagent(Invitrogen)、甘油磷酸钠（GP,SIGMA）、硝酸鈷、碳酸氢钠（上海化学试剂公司），等等。协作单位及协作内容落实情况 透射电镜观察在福建医大电镜室进行（已落实）。临床工作情况本课题暂不涉及临床部分。文献资料福建中医学院图书馆建有较完备的网上信息资源、文献检索数据库和藏书、期刊资源等满足课题需要.其他 导师审查意见 导师签名 年 月 日 开题小组评议意见（课题的先进性、科学性、可行性评价）参加开题成员签名 年 月 日 系（院、部）批准意见系（院、部）盖章 年 月 日备考检查及变动情况记录第一次检查及变动记录导师签名 年 月 日 第一次检查及变动记录导师签名 年 月 日 课题完成日期 年 月 日备注15