基因工程的基本操作程序教学设计-高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

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1、3.2 基因工程的基本操作程序一、教材分析（一）教学目标1.阐明基因工程的原理和基本操作程序。2.针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。3.尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。（二）教学重点和难点1.教学重点（1）基因工程基本操作程序的四个步骤。（2）DNA片段的扩增及电泳鉴定。2.教学难点（1）利用PCR获取和扩增目的基因。（2）DNA片段的扩增及电泳鉴定。（三）编写思路本节是本章的核心，具有承上启下的作用。本节内容体现了前一节介绍的“分子工具”的综合运用，涉及的技术和操作流程又是后一节介绍的基因工程应用的基础。本节开

2、篇“从社会中来”栏目中的内容与章引言相呼应，继续使用我国科学家取得的重大科技成果-成功培育转基因抗虫棉作为情境素材。与章引言从转基因抗虫棉产生的背景引人不同，这里突出了种植转基因抗虫棉产生的社会效益和经济效益，进而提出指向本节学习重点的问题，引导学生分析、讨论。本节对基因工程基本操作程序的介绍同样贯串在培育转基因抗虫棉的情境中。有了情境的依托，学生学习的积极性被调动起来，相关的知识不再孤立，便于学生理解和掌握。由于限定在一个具体的情境中，因此知识内容的范围会发生一定的变化。教材在保证学生知识结构的系统性和完整性的基础上，对有的内容进行了补充，有的内容进行了简化。例如，因为筛选合适的目的基因是基

3、因工程操作的第一步，也是转基因产品安全性的重要保障，所以教材中增加了对相关内容的阐述；因为在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家是人工合成了目的基因，而现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因，所以教材不再详细阐述从基因文库中获取目的基因的方法，只是简要提及还可以通过构建基因文库来获取目的基因；因为科学家是通过花粉管通道法将目的基因导入了棉花细胞，所以教材正文介绍了花粉管通道法，而将另一种导人目的基因的方法一农杆菌转化法的介绍放在了“资料卡”中，让学生阅读和了解等。上述内容的变化并不会对学生掌握本节学习的要点产生影响。本节教学难点颇多，学生学习有一定的困难，削枝强干能降低他

4、们学习的负担，提高学习的效果。在阐明了培育转基因抗虫棉的四个基本步骤后，教材再推而广之，概括了基因工程的基本操作流程，并简单补充介绍了基因工程涉及的其他技术和方法。最后，教材还升华了学生的情感，引导他们以科学、理性的态度对待基因工程取得的成果。本节“到社会中去”栏目中的内容还是与培育转基因抗虫棉有关，教材通过引导学生分析棉铃虫对转基因抗虫棉的抗性问题，来培养学生的工程思维，让他们认识到在进行工程设计、决策或风险评估时，不但要预估该工程近期的和直接的结果，还要预估远期的和间接的结果；既要预估工程产生的正面效益，又要预估它可能产生的负面影响，从而采取相应的防范措施。本节教材编写值得关注的还有，对教

5、学难点利用PCR获取和扩增目的基因的处理。教材首先结合学生学习过的DNA复制的知识帮助学生分析PCR所需的基本条件；然后通过一张对开页的大图让PCR需要的条件和设备、PCR的原理和反应过程一目了然；本节最后还安排了“探究实践DNA片段的扩增及电泳鉴定”活动，让学生学习相关操作，加深对PCR的认识。该实验的步骤较多，对学生统筹协调各个实验环节的能力提出了较高要求。特别提示教材中提到在PCR反应体系中加人了四种脱氧核昔酸，这是作了简化处理、便于学生理解的表述。在实际操作时，加入的是四种脱氧核昔三磷酸（dATP、dTTP、dGTP和dCTP）。这些分子都有三个磷酸基团，基团之间通过高能磷酸键相连。在

6、DNA聚合酶催化新链合成的过程中，每掺人一个核昔酸，伴随着两个高能磷酸键的断裂，由此释放出来的能量可以满足核昔酸聚合反应的需求。10二、教学建议本节内容较多，建议教学整体安排34课时，其中探究活动12课时。具体的教学建议如下。（一）让学生明确为什么基因工程的基本操作程序要分为四个步骤引导学生分析基因工程每一步操作的必要性，可以帮助他们真正理解基因工程的操作流程。为什么要有“目的基因的筛选与获取”这一步？建议引导学生回顾基因工程的概念：“基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。”可以说这既是概念，又是原理。这里所说的“更符

7、合人们需要”就是目的，那么更符合人们需要的那个基因就是目的基因了。有了目的基因，我们才能赋予一种生物新的遗传特性。为什么要有“基因表达载体的构建”这一步？因为单独的DNA片段-一目的基因是不能稳定遗传的。教材中提到构建基因表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。为什么要有“将目的基因导人受体细胞”这一步？因为含有目的基因的表达载体只有进人受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。为什么要有“目的基因的检测与鉴定”这一步？因为目的基因是否能够在受体细胞中稳定维持和表达它的遗传特性，只有通过检测与鉴定才

8、能知道。在学生明白了为什么基因工程的基本操作程序分为四个步骤的基础上，就可以让他们进入每一个环节有关技术和方法内容的学习了。（二）利用一个贯串的情境将基因工程的基本操作程序有机地串联起来基因工程操作的四个步骤是统筹协调、有序推进的，如果设计一个贯串的大情境将它们有机串联起来，不仅可以突出学习的主干，保持学生思维的连贯性，还能帮助他们形成对基因工程操作的整体认识，发展工程思维。例如，教材就是运用了培育转基因抗虫棉的情境来贯串本节内容，教学时同样可以用此情境来引导学生的学习；还可以让学生在课前搜集自己感兴趣的基因工程应用的实例，教师在汇总后选择一个学生最感兴趣的实例，作为贯串本节的情境。选择这种策

9、略备课量会有所增加，但由于是根据学生搜集的实例确定的情境主题，这在一定程度上可以激发学生的学习兴趣。需要注意的是，基因工程各个操作环节涉及的技术和方法较多，一个情境素材用到的只是某些特定的技术和方法，教师在教学时需要进行适当的补充介绍和说明，以增加学生认识的深度和广度，但是也不宜面面俱到，以免增加学生的学习负担。（三）联系学生学过的知识帮助他们理解技术的原理本节有的技术原理比较抽象，教学中可以结合学生已经学过的知识帮助他们理解。例如，基于DNA的复制，理解PCR的原理和PCR反应体系的组成；基于基因指导蛋白质合成的过程，理解目的基因的检测需要在多个层次上进行。（四）通过加强教学媒体的运用来突破

10、技术难点基因工程基本操作的各个环节都有一些技术和方法层面上的难点不好理解，如PCR反应的过程、基因表达载体的构建、农杆菌转化法等。教学中教师可以加强教学媒体的运用，搜集一些图片或制作动画视频等，并结合教材中的插图，为学生提供更加丰富的直观感受。相关内容可以既有静态的又有动态的、既有具体节点又有整个过程的呈现，从而帮助学生突破学习的难点。三、“探究?实践”指导DNA片段的扩增及电泳鉴定清华大学附属中学梁妹颈本实验通过让学生尝试进行PCR和琼脂糖凝胶电泳的基本操作，使他们体验这两项常规的分子生物学实验方法，帮助他们理解技术的原理，从而为今后运用这些技术打下基础。（一）材料准备试剂：可直接从公司购买

11、商品化的PCR试剂盒，PCR反应体系的配方可参考教材或试剂盒的说明书；进行琼脂糖凝胶电泳操作需要准备的试剂有电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料等。用具：PCR仪（可选用科学研究用的PCR仪，也可选用水浴锅式教学用的PCR仪以直观呈现PCR反应的过程）、电泳装置（包括电泳仪、连接线、电泳槽、制胶用的模具等）、微量离心，管（根据所选的PCR仪来确定微量离心管的规格）、微量移液器、一次性吸液枪头等。（二）实施建议1.配制PCR反应体系（1）在本实验中，需要使用微量移液器加入PCR反应体系的各个组分，让学生掌握正确的微量移液器的使用方法十分重要。移液时，应按照“容量设定吸液枪头安装预洗吸液枪

12、头吸液放液卸去吸液枪头”六个步骤进行，一些关键步骤的操作规范如下。吸液枪头安装：应采取旋转安装法，用力不能过猛。吸液：先向下按压推动杆至第一停点，然后将吸液枪头垂直浸人液面，再平稳松开。放液：将吸液枪头紧贴容器壁，先向下按压推动杆至第一停点，稍作停顿后再按至第二停点，确保吸液枪头内没有液体残留。在使用过程中，不能超量程使用微量移液器。使用一次性屏蔽式吸液枪头有助于防止吸取的液体流入微量移液器，从而减少实验过程中的交叉污染。（2）为保证加入反应体系中的各试剂体积的准确性，建议按照加入体积的大小，由大到小依，次加入各试剂，即最先加入无菌水。为保护酶的活性，一般最后加入Tag DNA聚合酶。（3）应

13、按照教材或试剂盒说明书建议的体积加入各试剂，随意加大试剂用量并不会提高PCR扩增的成功率。例如，高浓度的引物可能引发错配，导致非特异性扩增；高浓度的4种脱氧核昔酸可能对扩增起抑制作用。用哺乳动物基因组DNA作模板时，建议在反应体系中加入1pg模板；用酵母菌、细菌基因组DNA和质粒DNA作模板时，建议在反应体系中分别加入10 ng，1 ng和1pg模板。（II（4）如果所选用的PCR仪没有加热盖，需要在PCR反应体系配制好后加入液体石蜡进行封闭，以防止加热过程中液体蒸发。2.设置PCR仪的循环程序教材给出的参考时间对绝大多数实验都是适用的。扩增1 000 bp片段的延伸时间一般设定为1 min。

14、教师可根据目的片段长度适当调整延伸时间。3.琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是常用的分离、鉴定DNA的方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构象。在本实验中，主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。（1）制备琼脂糖凝胶时，当凝胶溶液冷却到不烫手时可加入核酸染料。科学研究中常用的核酸染料是澳化乙锭（EB），但由于它具有高致癌性，中学实验不建议使用，可用其他灵敏度高、毒性低的新型核酸染料替代它。（2）将凝胶放入电泳槽后，应确保加样孔内充满电泳缓冲液且没

15、有气泡，否则会影响加样。（3）DNA分子可发生两性解离，当电泳缓冲液的pH大于其等电点时，DNA分子带负电；当电泳缓冲液的pH小于其等电点时，DNA分子带正电。一般使用的电泳缓冲液的pH为8，DNA分子带负电，向正极泳动。教师应提醒学生注意电极方向。4，结果分析一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。（1）未出现扩增条带可能的原因有：模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂（如蛋白酶K、苯酚、EDTA）；Taq DNA聚合酶失活；引物出现质量问

16、题，浓度不合适；Mg*浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异；等等。（2）出现非特异性扩增条带可能的原因有：模板DNA出现污染；Taq DNA聚合酶出现质量问题；引物特异性不强（如与非目的序列有同源性）或形成引物二聚体；Mg2*浓度过高；退火温度（复性时的温度）过低；PCR循环次数过多；等等。（3）本实验应设置对照组（表3-1）。阳性对照用于检测PCR的效率，阴性对照用于检测是否存在含有目的序列的DNA的污染无关DNA：不包含目的序列，它和模板DNA在长度、浓度等方面均相近。模板DNA：用于PCR扩增的DNA。目的DNA：已知的包含目的序列的片段，可以是重组DNA、基因组DNA等，目的

17、DNA的浓度应与模板DNA的浓度相近。（三）注意事项1.为避免外源DNA等因素对实验结果的影响，建议在单独的实验室或者实验室中特定的区域进行本实验的相关操作。微量离心管、一次性吸液枪头、蒸馆水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理。2.实验用到的酶、引物、模板DNA、4种脱氧核昔酸的混合液、扩增缓冲液等均需要分装成小份（避免反复冻融），并在-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块或PCR冷冻冰盒上缓慢融化。四、答案和提示（一）从社会中来提示参见本节正文中的内容。（二）旁栏思考题1.提示 mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一

18、步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子（图3-1）。2.提示 有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导人了受体植物。（三）到社会中去1.提示 这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获

19、得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然底护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。2.科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。（1）基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久

20、性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因（如Cry1Aa和CrylAc基因）同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。（2）田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供底护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一

21、些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的底护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度（如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作），这些作物可以构成天然的底护所，一般无须种植非转基因棉花作为底护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。（3）国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进

22、行严格的安全性评价等。（四）练习与应用概念检测1.（1）；（2）；（3）2.D拓展应用1.提示 外源基因插入基因组中可能为单位点插人，或者同一染色体多位点插人，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插人的位点难以做到定点插人；插人的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因（-葡糖醛酸糖昔酶基因）的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。2.（1）crtl基因和psy基因 pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。（2）

23、不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。（3）提示 维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨酷生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。B-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与B-胡萝卜素合成的酶的基因转人了籼稻中，使其胚乳中富含B-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广黄金大米”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。在

24、学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们理性地表明观点和参与讨论。（五）探究实践1.提示 可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。2.提示 如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。五、背景资料（一）苏云金杆菌与Bt基因1911年，德国人在一个叫苏云金的地方发现了一种寄生在昆虫体内，具有很强的杀虫能力的细菌，将它命名为苏云金杆菌。苏云金杆菌是一种能产生苏云金杆菌伴孢晶体

25、蛋白（Bt抗虫蛋白）的革兰氏阳性细菌。用它可以制成微生物源低毒杀虫剂。1.Bt基因的杀虫机理苏云金杆菌在芽孢形成期，它体内的Bt基因可以编码产生Bt抗虫蛋白。Bt抗虫蛋白被目标昆虫摄食后，在昆虫消化道的碱性环境下被胰蛋白酶水解，形成毒素核心肽段。毒素核心肽段能与昆虫肠上皮细胞上的受体结合，结合后插入细胞磷脂双分子层，使细胞膜允许离子（如Na*、K*等）和寡糖（如蔗糖、麦芽糖等）自由通过，细胞的渗透压发生改变，从而导致昆虫中肠停止蟠动，中肠上皮细胞解离，昆虫停止进食。芽孢在肠中萌发，经被破坏的肠壁进入血腔，大量繁殖，使昆虫患败血症，最终死亡。12，13）目前已知的苏云金杆菌有许多变种，某些变种可

26、产生B-外毒素。B-外毒素是一种腺嘌吟核昔酸的衍生物，也能起杀虫作用。苏云金杆菌杀虫谱广，能防治上百种害虫，涉及鳞翅目（对鳞翅目幼虫特别有效）、鞘翅目、双翅目、膜翅目等。2.转Bt基因抗虫植物1987年，世界上首例转B1基因抗虫烟草和抗虫番茄植株分别培育成功。但早期的转Bt基因抗虫植株的抗虫性普遍较低，其体内Bt抗虫蛋白的含量只占可溶性蛋白的1/1 000，远远达不到农林业生产种植的要求。1990年，科学家通过对B1基因进行修饰，使其在棉花中的表达量大大提高，植株抗虫性明显增强，从而使转Bt基因抗虫技术在农林业中的应用成为可能。目前，Bt基因已经被成功转入玉米、水稻、马铃薯、番茄等农作物，以及

27、杨树、核桃、苹果等经济林木。20世纪90年代初期，一批转Bt基因抗虫植物实现了商业化种植，如转Bt基因的玉米、棉花和马铃著在美国和加拿大获准进行商业化种植。我国自20世纪80年代后期开始转基因抗虫植物的研究。1997年，我国批准了转Bt基因的抗虫棉在河北省种植。目前，转基因抗虫棉已在我国广泛种植。种植转Bt基因抗虫植物，可以避免大量使用化学方法防治害虫产生的一些危害，如造成生态污染、影响生态平衡等，具有可观的经济效益和环境效益。（二）高通量测序技术高通量测序技术又称二代测序技术，与一代测序技术相比，二代测序技术可以更低的成本提供更高通量的数据。目前三代测序技术已经诞生。1.一代测序技术代测序技

28、术以Sanger法为代表。Sanger法又叫作双脱氧链终止法，它以DNA合成反应为基础。Sanger法测定DNA序列的原理如图3-2所示。首先，在每个反应体系中加入同位素标记的引物，待测的DNA片段，足够量的脱氧核昔三磷酸（dATP、dGTP、dCTP和dTTP）和DNA聚合酶。然后，在四个反应体系中分别加人少量的2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP）进行PCR反应。以加入ddATP的反应体系为例，每次合成反应如果配对的为ddATP，反应就会停止，如果为dATP，反应可以继续，直到与ddATP配对反应才会停止，所以在该反应体系中会得到长短不一的，以ddA结尾

29、的片段。再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离四个反应体系中的产物并进行放射自显影，得到图谱后就可以读取核昔酸的排列顺序了。Sanger法操作简便，获得了科研人员的广泛认可，基于Sanger法的原理衍生出了多种测序技术。人类基因组计划的大部分测序工作就是通过Sanger法衍生出的技术平台实现的。以Sanger法为代表的一代测序技术目前可测长约1000 bp的DNA片段，测序结果可靠，准确率高达99.999%。但一代测序技术的通量低、成本相对较高，这限制了它的大规模应用。2.二代测序技术20世纪90年代，在基因组学发展的需求下，科研人员开发了通量更高、成本更低的测序技术。为了与以Sanger法为代表的

30、一代测序技术进行区分，他们将后来发展的测序技术称为二代测序技术。二代测序技术通常先将样品DNA打断成几百个碱基对长的片段，然后在片段两端加接头，进行PCR扩增和序列分析。二代测序技术也有一些缺点：测序产生的都是一些较短的序列，后续序列拼接的工作比较复杂；PCR扩增前后的DNA片段数目比例会有差异，不利于进行生物信息学分析。3.三代测序技术近年来，为了更加精确与高效地挖掘DNA的序列信息，科研人员研究、开发出三代测序技术，即单分子测序技术。三代测序技术与一代、二代测序技术不同，测序时不再需要进行PCR扩增，而是基于单分子水平边合成边测序，从而实现了对每个DNA分子的单独测序。三代测序技术与二代测

31、序技术相比，获得的序列较长，后续序列拼接的工作相对简单。总的来说，三代测序技术相较于前两代测序技术，具有超长读长、运行快、无须模板扩增、可直接检测表观遗传修饰位点等特点，它主要用于基因组测序、甲基化研究、突变鉴定等领域，所得数据适于进行生物信息学分析。虽然三代测序技术的优点非常多，但该技术尚处于发展阶段，还未成熟和实现多元化，成本较高，目前多用于科学研究，商业化程度较低。（三）常用的序列数据库1.常用的核酸序列数据库核酸序列数据库综合了DNA、RNA序列数据，这些数据源于众多的研究机构、核酸测序小组等发布的序列研究成果。目前主要有GenBank，EMBL（the European Molecu

32、lar Biology Laboratory）以及DDBJ（DNA Data Bank of Japan）三大核酸序列数据库。（16）GenBank数据库是在科研工作中经常用到的数据库之一，它由美国国家生物技术信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）建立和维护，于1979年开始建设，1982年正式运行。该数据库包含了所有已知的核酸序列和蛋白质序列，以及与它们相关的文献著作和生物学注释。EMBL数据库由欧洲生物信息学研究所（European Bioinformatics Institute）维护，于1982年开始服务

33、。DDBJ数据库由日本于1984年开始建设，1987年开始服务。它与GenBank和EMBL数据库合作交换数据，是一个全面的核酸序列数据库。2.常用的蛋白质序列数据库蛋白质序列数据库汇集了蛋白质的各种参数。蛋白质序列数据库主要有SWISS-PROT、PIR（Protein Information Resource）、TrEMBL（Translated EMBL）、UniProt（Universal Protein）等。其中，UniProt数据库是信息和资源最丰富的蛋白质序列数据库，它由SWISS-PROT、TrEMBL和PIR三大数据库的数据整合而成。UniProt数据库主要包括三个部分，分别

34、是蛋白质知识库（UniProt Knowledgebase，UniProtKB）、蛋白质序列归档库（UniProt Sequence Archive，UniParc）和蛋白质序列参考集（UniProt Reference Clusters，UniRef）。为适应蛋白质组学研究的需要，UniProt数据库还新增了蛋白质组和参考蛋白质组数据。此外，UniProt数据库还包括文献引用、物种分类学来源、亚细胞定位、数据库交叉链接等辅助数据。UniProt数据库从创建至今，一直遵循着人类基因组计划实施时国际科学界达成的共识，即基因组、蛋白质组等的生物信息数据资源应该为全人类共享，为世界各国公众提供无偿服

35、务。（四）序列比对及其常用工具序列比对是指对两个或多个核酸或蛋白质序列进行比较分析，发现序列间的异同，由此显示出序列间的相似程度或同源程度的方法。在生命科学研究中，序列比对可以提供许多有用的信息。例如，克隆目的基因之后，往往要对目的基因进行测序，并将测序的结果与数据库中该基因的序列进行比对，以保证获得了序列正确的DNA片段。又如，可以通过比对不同物种的核酸序列或蛋白质序列，了解它们之间的相似程度或同源程度，在生物进化研究中，这样的序列比对为判断物种间的进化关系提供了有效的证据。科研人员可以借助一些序列比对工具来进行序列比对，最常用的是美国国家生物技术信息中心研发的比对工具BLAST（Basic

36、 Local Alignment Search Tool）。利用BLAST可以比对两个或多个已知序列的相似程度，也可以在数据库中检索与已知序列相似度较高的其他序列，从而为科学研究提供依据。（五）从基因文库中获取目的基因的方法从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。下面介绍一种根据基因的部分核昔酸序列找到目的基因的方法。第一步，通过PCR将目的基因已知的部分核昔酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法，如用生物素、荧光素等进行标记）。第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维素膜上（也可以用其他类型的膜），通过处理溶解消化掉细菌中的蛋

37、白质，并使DNA固定在膜上。第三步，用上述标记了放射性同位素的DNA片段作为探针，与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交。第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光。在X光底片上出现黑斑的菌落中含有所需要的目的基因（若选用其他标记方法，则有阳性信号的菌落含有所需要的目的基因）。第五步，从该菌落中提取目的基因。（六）PCR的种类和应用随着科学技术的不断发展，科研人员在基本PCR的基础上进行了大量改进，开发了许多适用于不同研究目的的PCR，如兼并引物PCR、套式引物PCR、反向PCR、不对称PCR、逆转录PCR、实时PCR等。这些技术已经广泛应用于基因工程、临床检验、遗传病诊断等领域。下面重

38、点介绍逆转录PCR和实时PCR。1.逆转录PCR逆转录PCR（reverse transcription PCR）又叫作RT-PCR，是从mRNA获得cDNA（互补DNA）并进行扩增的一种实验技术。进行逆转录PCR时，通常要先提取总RNA；然后以其中的mRNA为模板，利用oligo（dT）（寡脱氧胸昔酸）或随机引物在逆转录酶的作用下合成cDNA；再以cDNA为模板进行常规的PCR扩增。oligo（dT）是由数量少于20的脱氧胸苷酸连接而成的核苷酸链，它可以特异性地结合到mRNA的poly（A）尾端（多A尾），从而将mRNA从总RNA中分离出来。2.实时PCR实时PCR（real-time PC

39、R）是一种定量测定样品中特定DNA片段的聚合酶链式反应。反应中一般使用带有荧光标记的PCR引物，从而能够通过荧光监测每次PCR循环后扩增所得的产物的量。通过连续监测下获得的反应动力学曲线，可推导出样品中模板DNA的初始含量。由于实时PCR可以对初始模板DNA进行定量分析，因此该技术在科研工作中应用广泛。例如，可以用来对比相同基因在不同组织中的相对表达量，以及对比同一组织中不同基因的相对表达量。以对比A基因在拟南芥根和叶中的表达情况为例，可以先分别提取拟南芥根和叶的RNA；然后将其逆转录为cDNA；再以cDNA为模板来进行实时PCR；最后基于PCR的结果就可以对A基因在拟南芥根和叶中的相对表达情

40、况进行分析。（七）构建基因表达载体时需要考虑的因素构建基因表达载体的目的是为了顺利实现目的基因的表达，即让目的基因能够顺利完成转录和翻译这两个过程。据此，在构建基因表达载体时，需要考虑以下因素。1.转录有效起始目的基因能够表达的第一个关键步骤就是有效起始转录。选择强的可调控的启动子及相关的调控序列是构建一个高效表达载体首先需要考虑的问题。构建基因表达载体常用的启动子一般可以分为组成型启动子和诱导型启动子。组成型启动子是指在生物体的所有组织中都有活性的启动子。例如，在双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子；T7噬菌体启动子也是一种常用的组成型启动子，因为T7

41、RNA聚合酶几乎能完整地转录由该启动子调控的所有DNA序列，从而能够实现目的基因的高效表达。诱导型启动子是指能被诱导表达的启动子。常见的诱导型启动子有Lac乳糖操纵子以及在此基础上衍生出的多种诱导型启动子。2.mRNA 有效延伸和转录顺利终止转录有效起始后，需要保证目的基因的mRNA能够有效延伸并顺利终止转录。在转录过程中，衰减子和非特异性终止都可能诱发转录中的mRNA分子提前终止转录。衰减子位点具有简单的终止子的特性，是负调控元件。为了保证转录的顺利进行，在构建基因表达载体时要尽量去除衰减子位点。同时，还可以加入抗终止序列元件来防止mRNA在转录过程中非特异性终止。9转录的顺利终止对基因表达

42、载体来说十分重要，因此在构建基因表达载体时一定要有正常的转录终止序列以防止不必要的转录，增加外源基因的稳定性。例如，对真核细胞而言，基因表达载体需要含有终止序列以及poly（A）信号序列。3.翻译有效起始翻译过程的有效起始是目的基因高效表达的关键之一。在原核细胞中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（RBS）、起始密码子与RBS之间的距离、mRNA的二级结构，以及mRNA上游的5端非翻译序列等。在构建基因表达载体时，可以注意以下几个方面以最大效率地起始翻译。（1）AUG是首选的起始密码子。（2）一般RBS序列至少含有AGGAGG中的4个碱基。（3）RBS与起始密码子之间的距离以61

43、2 bp为宜。（4）起始密码子之后的序列是GCAU或AAAA，翻译效率会提高。（5）翻译起始周围的序列不能形成明显的二级结构。4.保证翻译的终止效率三个终止密码子UAA、UAG、UGA的翻译终止效率是不同的，其中UAA的终止效率最高，特别是在原核细胞中。在设计基因表达载体时，为了保证翻译的有效终止，一般采用串联终止密码子。5.保证外源蛋白的稳定性在保证顺利完成转录和翻译过程之后，构建基因表达载体时还需要考虑如何保证外源蛋白能够在宿主细胞中稳定积累，不被内源蛋白水解酶降解。例如，可以通过添加信号肽使合成的蛋白质分泌到培养基中；或者构建融合蛋白，通过构象的改变，使外源蛋白不被选择性降解；或者使外源

44、蛋白以包涵体的形式表达等。（八）目的基因是否导人受体细胞的检测检测目的基因是否导人受体细胞的方法主要有以下几种。1，载体表型选择法基因工程中使用的载体往往会携带选择性标记，最常见的是携带一个或多个抗生素的抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等。受体细胞本身对某种抗生素是敏感的，在含有该抗生素的培养基上无法生长；当携带该抗生素抗性基因的载体转入受体细胞后，受体细胞可以在含有该抗生素的培养基上生长，从而达到筛选的目的。需要注意的是，这种方法只能检测载体是否成功转入，其中可能包括自身环化的载体，所以要确定目的基因是否真的转人，还必须借助其他筛选方法。-半乳糖昔酶显色反应选

45、择法，即我们常说的蓝白斑筛选法，也是一种常用的检测目的基因是否导人受体细胞的方法。这种检测方法用到的载体上含有LacZ基因，其表达产物为无活性的a肽段。受体细胞可以合成无活性的w肽段。a肽段与w肽段结合后可以产生有活性的-半乳糖昔酶，将无色的5-澳-4-氯-3-吲噪-D-半乳糖苷（X-gal）水解成蓝色产物。如果目的基因插入LacZ基因上的多克隆位点，重组载体转人受体细胞后就不能产生B-半乳糖昔酶，无法将X-gal水解成蓝色产物，因此在筛选平板上含有重组载体的菌落呈白色。2.DNA电泳检测法DNA电泳检测法是基因工程中常用的检测目的基因是否导入受体细胞的方法。可以提取受体细胞中的质粒直接进行电

46、泳检测，但由于含有目的基因的重组质粒分子质量一般比较大，在电泳凝胶中的迁移速率较慢，为了增加实验的准确度，可以选择合适的限制酶对质粒进行酶切后再进行电泳检测，同时可借助指示分子大小的标准参照物来进一步确认目的基因。除此之外，还可以以质粒为模板进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。设计PCR的一对引物时，最好一个引物与质粒DNA互补结合，另一个引物与目的基因DNA互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物，从而进一步增加了实验的可信度。DNA电泳检测法可以与前面介绍的载体表型选择法相结合，来快速、准确地检测目的基因是否导人受体细胞。3.核酸杂交检测法Southern印记杂交是核酸杂交检测

47、法中的一种，用于对DNA分子的检测。用这种方法检测目的基因是否导入受体细胞的基本过程是：先提取受体细胞的DNA；用限制酶对DNA分子进行酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳；然后对分离后定位在凝胶上的不同分子质量的DNA进行碱变性处理，并将凝胶中变性的DNA转移至硝酸纤维素膜或其他固相支持物上固定；再用相应的带有标记的探针进行杂交，经放射自显影，就可以鉴别出目的基因。如果需要进行大量的筛选，如基因文库的筛选，可以选用菌落原位杂交法。具体操作流程是：先将转化的菌落影印在滤膜上；然后通过溶菌和核酸变性处理，使核酸暴露并与滤膜原位结合；再用特异性的核酸探针进行杂交，经放射自显影，就可以鉴别出目的基因；最后从原

48、来的培养基上选出相应的菌落。六、教学评析与案例基因工程的基本操作程序北京汇文中学庞明教学目标的确定与本节内容对应的课程标准的“内容要求”是：阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导人受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。结合教材内容，确定本节的教学目标如下。1.阐明PCR的原理，说出PCR反应所需的条件和PCR反应的过程。2.说出基因表达载体的组成。3.列举将目的基因导人植物细胞、动物细胞和微生物细胞的方法。4.列举检测与鉴定目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达其遗传特性的方法。5.能够用流程图的形式概括出基因工程的基本操作程序。6.针对人类生产或生活中的某一需求，能运用基因工程技术尝试设计获得某一转基因产品的方案。7.能够基于对基因工程的原理和操作流程的认识，以理性的态度对待基因工程的研发和应用，认同我国科研工作者在基因工程领域取得的成就。教学设计思路教学实施程序第1课时第2课时评析本案例的主要特点如下。1，教学主线清晰本案例两节课的教学分别贯串在两个大的情境中：第一节课以转基因抗虫棉的培育过程为