生化分离技术3.5 电泳技术电子课件 .ppt
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1、生化分离技术3.5电泳技术电子课件 电泳技术电泳技术【项目简介】l浓缩是从溶液中除去部分溶剂的单元操作。浓缩和干燥都是采用一定的生产技术去除料液中的溶剂,但是有所不同。浓缩过程中,水分在物料内部是借对流扩散作用从液相内部达到液相表面而后除去,最低水分含量约30%(质量),一般为稳定状态的过程。而干燥过程中,水分在物料内部最终必将借分子扩散作用从固相中除去,且一般为不稳定状态的过程。l生化物质制备中,物质提取后、结晶前和制成高浓度原液时,一般要进行浓缩操作;分离纯化过程中及纯化所得物质溶液制成固态原料或成品时,需要进行干燥操作。浓缩和干燥技术是生化物质分离纯化工艺中不可或缺的技术。【知识要求】l
2、(1)了解浓缩技术和干燥技术的各种方法。l(2)理解蒸发浓缩和冷冻浓缩的原理。l(3)理解热干燥和冷冻干燥的原理。l(4)理解红外干燥和微波干燥的原理。【技能要求】l(1)能够根据原料特征选择适宜的浓缩方法。l(2)能够根据原料特征选择适宜的干燥方法。l(3)能够认识和操作浓缩设备。l(4)能够认识和操作干燥设备。任务一电泳技术l一、电泳技术发展史l l18091809年俄国物理学家年俄国物理学家ReussReuss进行了世进行了世界上第一次电泳实验界上第一次电泳实验l l19371937年,瑞典科学家年,瑞典科学家TiseliusTiselius设计了设计了世界上第一台电泳仪,建立了移界电世
3、界上第一台电泳仪,建立了移界电泳法,并于泳法,并于19481948年荣获诺贝尔奖。年荣获诺贝尔奖。7070年以来,电泳技术围绕制胶、电泳、年以来,电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节,不断改进,以实染色三个技术环节,不断改进,以实现下列目标:现下列目标:1 1、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。2 2、简化操作,缩短电泳时间。、简化操作,缩短电泳时间。3 3、扩大应用范围。、扩大应用范围。l l各类电泳技术已广泛应用于生命科学各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。各个领域。二、电泳的基本原理l电泳技术是使用电泳仪,利用带电微粒在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象把
4、物质分离的技术。在一定在一定pHpH条件下,每一种分子都具有条件下,每一种分子都具有特定的电荷(种类和数量)、大小和形特定的电荷(种类和数量)、大小和形状,状,在一定时间内它们在相同电场中泳在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同,各自集中到特定的位置上动速度不同,各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。的基本原理。l 在电场中,推动带电质点在电场中,推动带电质点运动的力(运动的力(F F)等于质点等于质点所带净电荷量(所带净电荷量(Q Q)与电场强度()与电场强度
5、(E E)的乘积。)的乘积。l F FQ EQ El质点的前移同样要受到质点的前移同样要受到阻力(阻力(F F)的影响的影响,即:即:FF6 r6 r 式中式中:r r粒子半径,粒子半径,介质黏度,介质黏度,v v泳动速率泳动速率l当质点在电场中作稳定运动时:当质点在电场中作稳定运动时:QEQE6r6rl上式交换后可写成上式交换后可写成 /E/EQ/6rQ/6rl/E/E的含意为单位电场强度下的移动速度,这里的含意为单位电场强度下的移动速度,这里可用迁移率可用迁移率表示,即表示,即 /E/EQ/6rQ/6rl从上式可见,球形质点的迁移率,首先取决于自从上式可见,球形质点的迁移率,首先取决于自身
6、状态,即与身状态,即与所带电量成正比所带电量成正比,与其半径及介质与其半径及介质粘度成反比粘度成反比。除了自身状态的因素外,电泳体系。除了自身状态的因素外,电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。中其它因素也影响质点的电泳迁移率。三、影响电泳迁移速率的因素三、影响电泳迁移速率的因素l样品本身:带电量,分子大小,形状样品本身:带电量,分子大小,形状l电场强度:电压电场强度:电压l缓冲液:成分,缓冲液:成分,pH pH,离子强度,离子强度l温度温度l支持介质:电渗作用,吸附作用支持介质:电渗作用,吸附作用(1 1)样品本身:)样品本身:带电量、分子大小、形状。带电量、分子大小、形状。Q Q越多,
7、越多,V V越越大;大;r r越小,越小,V V越大;球形分子越大;球形分子 纤维状纤维状(2 2)电场强度:)电场强度:X X越大,越大,V V越大越大 常压电泳:电场强度在常压电泳:电场强度在2 210 V/cm10 V/cm。高压电泳:电场强度在高压电泳:电场强度在2020200 V/cm200 V/cm。(3 3)缓冲液:)缓冲液:pH pH 决定决定Q Q,(pH-PI)(pH-PI)越大,越大,Q Q越多,越多,V V 越大;成分:性质稳定,不易电解。越大;成分:性质稳定,不易电解。离子强度:离子强度:0.02-0.2M0.02-0.2M。I I越大,样品电流减小,越大,样品电流减
8、小,V V 变小;变小;I I越小,样品电流越大,越小,样品电流越大,V V越大,但样品易扩越大,但样品易扩 散。散。(5 5)支持介质:)支持介质:惰性材料,有一定坚韧度,以保存;惰性材料,有一定坚韧度,以保存;吸附力要小;无电渗作用吸附力要小;无电渗作用 电渗现象:电渗现象:液体对固体的相对移动,由缓冲液的液体对固体的相对移动,由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。电渗与电泳方向相同,所引起。电渗与电泳方向相同,V V变大;反之变小。变大;反之变小。吸附现象吸附现象 +-液相固相电渗流电渗示意图分子筛效应:分子筛效应:
9、分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。分子量小,阻力小,移动快;分子量大,阻力大,移动慢。应。分子量小,阻力小,移动快;分子量大,阻力大,移动慢。图中图中图中图中A A A A,B B B B,C C C C均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子,在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为分子量大小依次为分子量大小
10、依次为分子量大小依次为MA=MBMCMA=MBMCMA=MBMCMA=MBMC,所带电荷量相同,所带电荷量相同,所带电荷量相同,所带电荷量相同Q Q Q QA A A A=Q=Q=Q=QB B B B=Q=Q=Q=QC C C C。ABC+-l四、电泳设备l电泳仪主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。l电泳槽主要有水平式和垂直式两类(二)电泳仪的使用方法l1.首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接,注意极性不要接反。l2.电泳仪电源开关调至关的位置,电压旋钮转到最小,根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。l3.接通电源,缓缓
11、旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止,设定电泳终止时间,此时电泳即开始进行。l4.工作完毕后,应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态,并拨出电泳插头。(三)电泳仪使用注意事项l1.电泳仪通电进入工作状态后,禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分,也不能到电泳槽内取放东西,如有需要时,应先断电,以免触电。良好接地端,以防漏电l2.仪器通电后,不要临时增加或拨除输出导线插头,以防短路现象发生。l3.不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。l4.在总电流不超过仪器额定电流时(最大电流范围),可以多槽关联使用,但要注意不能超载。l5.某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时,允许在稳压状态下空载
12、开机,但在稳流状态下必须先接好负载再开机,否则电压表指针将大幅度跳动,容易造成不必要的人为机器损坏。l6.使用过程中发现异常现象,如较大噪音、放电或异常气味,须立即切断电源,进行检修,以免发生意外事故。五、常用的电泳技术及其应用(一)聚丙烯酰氨凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel,PAGEpolyacrylamide gel,PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称:Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称:Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidege
13、lelectrophoresis,PAGE)。CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,
14、N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、琼脂糖凝胶 从琼脂中精制分离出的胶状多糖,其分子结构大部从琼脂中精制分离出的胶状多糖,其分子结构大部分是由分是由1,31,3连接的连接的-D-D吡喃半乳糖和吡喃半乳糖和1,41,4连接的连接的3,63,6脱水脱水-D-D吡喃半乳糖交替形成的;吡喃半乳糖交替形成的;对于分子量较大的样品对于分子量较大的样品,如大分子核酸、病毒等,如大分子核酸、病毒等,一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差琼脂糖凝胶约可区分相差100bp100bp的的DNADNA片段,其分辨片
15、段,其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围率虽比聚丙烯酰胺凝胶低,但它制备容易,分离范围广。广。琼脂糖凝胶的性能、结构与特点其优点如下其优点如下其优点如下其优点如下:l l琼脂糖凝胶孔径较大琼脂糖凝胶孔径较大琼脂糖凝胶孔径较大琼脂糖凝胶孔径较大,0.075%0.075%0.075%0.075%琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为800nm800nm800nm800nm,可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较凝胶可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较凝胶可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较凝胶可以分析百万道尔顿分子量的大分子,但分辨率较凝胶电
16、泳低。电泳低。电泳低。电泳低。l l机械强度高:可以在浓度机械强度高:可以在浓度机械强度高:可以在浓度机械强度高:可以在浓度1%1%1%1%以下使用;以下使用;以下使用;以下使用;l l无毒;无毒;无毒;无毒;l l染色、脱色程序简单,背景色较低;染色、脱色程序简单,背景色较低;染色、脱色程序简单,背景色较低;染色、脱色程序简单,背景色较低;l l热可逆性热可逆性热可逆性热可逆性;l l生物中性生物中性生物中性生物中性:一般不与生物材料结合;:一般不与生物材料结合;:一般不与生物材料结合;:一般不与生物材料结合;电泳系统的基本组成l l电泳槽:电泳槽:电泳槽:电泳槽:是凝胶电泳系统的核心部分,
17、管式电泳槽、垂直是凝胶电泳系统的核心部分,管式电泳槽、垂直是凝胶电泳系统的核心部分,管式电泳槽、垂直是凝胶电泳系统的核心部分,管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽板电泳槽、水平板电泳槽板电泳槽、水平板电泳槽板电泳槽、水平板电泳槽l l电源电源电源电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳200-600V200-600V200-600V200-600V,载体两性电解质等,载体两性电解质等,载体两性电解质等,载体两性电解质等电聚焦电泳电聚焦电泳电聚焦电泳电聚焦电泳1000-2000V1000-2000V1000-2000V1000-2000V,固相梯度等电聚焦
18、,固相梯度等电聚焦,固相梯度等电聚焦,固相梯度等电聚焦3000-8000V3000-8000V3000-8000V3000-8000Vl l外循环恒温系统外循环恒温系统外循环恒温系统外循环恒温系统:高电压会产生高热,需冷却;高电压会产生高热,需冷却;高电压会产生高热,需冷却;高电压会产生高热,需冷却;l l凝胶干燥器凝胶干燥器凝胶干燥器凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥;用于电泳和染色后的干燥;用于电泳和染色后的干燥;用于电泳和染色后的干燥;l l灌胶模具:灌胶模具:灌胶模具:灌胶模具:制胶,玻璃板和梳子;制胶,玻璃板和梳子;制胶,玻璃板和梳子;制胶,玻璃板和梳子;l l电泳转移装置:电泳转移
19、装置:电泳转移装置:电泳转移装置:利用低电压,大电流的直流电场,使凝胶利用低电压,大电流的直流电场,使凝胶利用低电压,大电流的直流电场,使凝胶利用低电压,大电流的直流电场,使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上,如电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上,如电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上,如电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上,如PVDFPVDFPVDFPVDF膜膜膜膜l l电泳洗脱仪:电泳洗脱仪:电泳洗脱仪:电泳洗脱仪:回收样品回收样品回收样品回收样品l l凝胶扫描和摄录装置:凝胶扫描和摄录装置:凝胶扫描和摄录装置:凝胶扫描和摄录装置:对电泳区带进行扫描,从而给出定对电
20、泳区带进行扫描,从而给出定对电泳区带进行扫描,从而给出定对电泳区带进行扫描,从而给出定量的结果。量的结果。量的结果。量的结果。电泳的一般过程水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直电泳槽及灌胶模具垂直电泳槽及灌胶模具 垂直板垂直板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头,大分电泳过程中分子迁移的规律,小分子走在前头,大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子夹在
21、两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳前的准备工作l l缓冲系统的选择:缓冲系统的选择:缓冲系统的选择:缓冲系统的选择:保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持;性的保持;性的保持;性的保持;电泳时间和分辨率:从理论上讲电泳时间和分辨率:从理
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