细胞工程基本技术.pptx

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1、会计学1细胞工程基本技术细胞工程基本技术一、细胞工程实验室的设置一、细胞工程实验室的设置 1 动物细胞工程实验室的设置动物细胞工程实验室的设置 无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间无菌操作室：更衣间、缓冲间、操作间 培养观察室培养观察室 制备室制备室 储藏室储藏室 清洗与灭菌室清洗与灭菌室 第1页/共71页n n2 2 植物细胞工程实验室的设置植物细胞工程实验室的设置n n 除与动物细胞工程实验室相同的除与动物细胞工程实验室相同的设置外，还有些特殊要求，如光照、设置外，还有些特殊要求，如光照、试管苗培育和移植驯化等。试管苗培育和移植驯化等。第2页/共71页二、常用仪器与设备二、常用仪器与设备超净

2、工作台超净工作台倒置显微镜和相差显微镜倒置显微镜和相差显微镜干燥箱干燥箱水纯化装置水纯化装置冰箱（冰箱（4、-20、-70）压力蒸汽消毒器压力蒸汽消毒器第3页/共71页n n细胞记数板和电子细胞记数板和电子细胞记数仪细胞记数仪n n过滤除菌装置过滤除菌装置n n离心机离心机n n移液管、吸管移液管、吸管n n离心管离心管n n移液器移液器n n天平天平第4页/共71页动物细胞工程实验室基本设备仪器动物细胞工程实验室基本设备仪器 1 培养箱培养箱二氧化碳培养箱，提供恒定二氧化碳培养箱，提供恒定CO2（5%）以稳定以稳定pH值，温度：哺乳类值，温度：哺乳类35-37，鸟类，鸟类38.5，气相：，气

3、相：O2、CO2、pH7.2-7.42 显微操作仪仪 3 细胞融合仪 第5页/共71页4 细胞冷冻储存器细胞冷冻储存器（程序化冷冻仪和液氮罐（程序化冷冻仪和液氮罐-196）5 培养用器皿培养用器皿 各种培养瓶、培养皿、多孔培养板（6、24、96）6 手术器械等手术器械等第6页/共71页植物细胞工程实验室基本设备仪器植物细胞工程实验室基本设备仪器光照培养箱光照培养箱人工气候室人工气候室摇床摇床培养瓶培养瓶第7页/共71页三、实验室的生物安全三、实验室的生物安全 根据密封程度的不同根据密封程度的不同,将生物安全分为四个等级将生物安全分为四个等级,即即:P1、P2、P3、P4 （protect）一般

4、细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求是：一般细胞培养按一级生物安全标准，其基本要求是：1、限制随便出入实验室；、限制随便出入实验室；2、操作前后要消毒；、操作前后要消毒；3、不能用口吸取液体；、不能用口吸取液体；4、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；、禁止在室内进食、吸烟和存放食品；5、操作时着专门实验服；、操作时着专门实验服；6、处理细胞前后要洗手；、处理细胞前后要洗手；7、操作时在超净工作台。、操作时在超净工作台。第8页/共71页四、培养用品的清洗四、培养用品的清洗n n在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生在培养物中无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件，因此对培养器皿的清洗和存的首要条件

5、，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。灭菌是极为重要的环节。n n 清洗的目的是清除杂质和微生物清洗的目的是清除杂质和微生物,使器皿使器皿内不残留任何影响细胞生长的成分内不残留任何影响细胞生长的成分(有害物有害物质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成质、微生物、细胞碎片及非营养性化学成分）。分）。第9页/共71页第10页/共71页1、玻璃用品的清洗、玻璃用品的清洗 在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百迹，而且不能残留任何

6、物质。某些化学物质仅百万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此，万分之一毫克，就会对细胞产生毒性作用。因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。和冲洗四个步骤。第11页/共71页 浸泡浸泡 初初次次使使用用和和培培养养用用后后的的玻玻璃璃器器皿皿都都需需先先用用清清水水浸浸泡泡，以以使使附附着着物物软软化化或或被被溶溶掉掉。培培养养后后的的玻玻璃璃器器皿皿多多附附有有大大量量蛋蛋白白质质，用用完完后后应应立立即即初初步步刷刷洗洗，浸浸泡泡在在蒸蒸馏馏水水中中，注

7、注意意让让水水完完全全进进入入瓶瓶皿皿中中，不不要要留留有有气气泡泡。使使用用新新的的器器皿皿应应先先用用自自来来水水简简单单刷刷洗洗，然然后后用用稀稀盐盐酸酸(5)浸浸泡泡过过夜夜或或煮煮沸沸30分分钟钟，中和其中的碱性物质后再清洗。中和其中的碱性物质后再清洗。刷洗刷洗 浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂（加热）刷洗。热）刷洗。第12页/共71页 浸酸浸酸 刷刷洗洗不不掉掉的的极极微微量量杂杂质质经经过过清清洗洗液液浸浸泡泡的的强强氧氧化化作作用用可可被被除除掉掉。清清洗洗液液对对玻玻璃璃器器皿皿无无腐腐蚀蚀作作用用，去去污污十十分分有有效效，是

8、是清清洗洗过过程程中中关关键键环环节节。清清洗洗液液是是由由重重铬铬酸酸钾钾、浓浓硫硫酸酸和和水水按按一一定定比比例例配配制制而而成成。浸浸泡泡时时器器皿皿要要充充满满洗洗液液，不不留留气气泡泡。浸浸泡泡时时间间不不应应少少于于6小小时时，一一般应浸泡过夜。般应浸泡过夜。第13页/共71页n n清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面清洗液可根据需要，配制成不同强度：常用的有下面三种：三种：三种：三种：n n强液：重铬酸钾强液：重铬酸钾强液：重铬酸钾强液：重铬酸钾6363g g，浓硫酸浓硫酸浓硫酸

9、浓硫酸10001000mlml，蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水200200mlmln n次强液：重铬酸钾次强液：重铬酸钾次强液：重铬酸钾次强液：重铬酸钾120120g g，浓硫酸浓硫酸浓硫酸浓硫酸200200mlml，蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水10001000mlmln n弱液：重铬酸钾弱液：重铬酸钾弱液：重铬酸钾弱液：重铬酸钾l00gl00g，浓硫酸浓硫酸浓硫酸浓硫酸l00mll00ml，蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水10001000mlmln n n n 配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入配制时先将重铬酸钾完全溶解于水，然后缓慢加入配制时先将重铬酸钾

10、完全溶解于水，然后缓慢加入浓硫酸。浓硫酸。浓硫酸。浓硫酸。n n 新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水份增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液已失效，应废弃而重新配置。应废弃而重新配置。应废弃而重新配置。应废弃而重新配置。n n n n 也可以使用也可以使用也可以使用也可以使用10104040的硝酸溶液。的硝酸溶液。的硝酸

11、溶液。的硝酸溶液。第14页/共71页 冲洗冲洗 玻玻璃璃器器皿皿浸浸酸酸后后必必须须用用流流水水充充分分冲冲洗洗，每每个个器器皿皿用用流流水水灌灌满满、倒倒掉掉，必必须须重重复复十十次次以以上上，不不留留任任何何残残迹迹。最最后后用用蒸蒸馏馏水水漂漂洗洗23次次，用双蒸水漂洗用双蒸水漂洗1次，烤干备用。次，烤干备用。玻玻璃璃滤滤器器原原则则上上与与玻玻璃璃器器皿皿清清洗洗相相同同。无无论论是是浸浸泡泡还还是是浸浸酸酸、冲冲洗洗，都都需需用用抽抽滤滤的的方方法。法。第15页/共71页2、橡塞清洗、橡塞清洗 新新购购置置的的瓶瓶塞塞带带有有大大量量滑滑石石粉粉及及杂杂质质，应应先先用用自自来来水水

12、冲冲洗洗。胶胶塞塞类类橡橡胶胶用用品品，每每次次用用后后先先用用蒸蒸馏馏水水浸浸泡泡，然然后后用用2NaOH煮煮沸沸10-20 min，用用自自来来水水冲冲洗洗干干净净，再再用用1稀稀盐盐酸酸浸浸泡泡30min，用用自自来来水水冲冲洗洗、蒸蒸馏馏水水漂漂洗洗2-3次次，最最后后双双蒸蒸或或三三蒸蒸水水漂漂洗洗1次，晾干后备用。次，晾干后备用。第16页/共71页n n3 3、塑料器皿的清洗、塑料器皿的清洗、塑料器皿的清洗、塑料器皿的清洗n n 细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培

13、养瓶等。这些产品主要是进口的培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。一次性商品，己消毒灭菌，打开就可使用。n n 如想反复使用，清洗方法如下：用后立即如想反复使用，清洗方法如下：用后立即如想反复使用，清洗方法如下：用后立即如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉清拭掉残

14、留附着物，用残留附着物，用残留附着物，用残留附着物，用2 2NaOHNaOH浸泡过夜，流水冲浸泡过夜，流水冲浸泡过夜，流水冲浸泡过夜，流水冲净后再用净后再用净后再用净后再用5 5盐酸浸泡盐酸浸泡盐酸浸泡盐酸浸泡3030minmin，自来水冲洗、自来水冲洗、自来水冲洗、自来水冲洗、蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗2323次，最后三蒸水漂洗次，最后三蒸水漂洗次，最后三蒸水漂洗次，最后三蒸水漂洗2 2次，晾次，晾次，晾次，晾干备用。干备用。干备用。干备用。第17页/共71页五、消毒灭菌五、消毒灭菌n n防止细菌、真菌和病毒等微生物的污染。n n消毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用不同的方法

15、。总的来说有物理方法和化学方法两大类。n n 物理法包括：湿热(高压蒸气)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物。n n 化学法是使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。第18页/共71页（一）物理灭菌法（一）物理灭菌法1、紫外线消毒、紫外线消毒 常用来消毒空气，操作表面和一些不能用常用来消毒空气，操作表面和一些不能用其它方法消毒的物品其它方法消毒的物品(如塑料培养皿等如塑料培养皿等)。一般。一般距紫外灯距紫外灯2.5米范围内直接照射米范围内直接照射20分钟即可。分钟即可。、电离辐射消毒、电离辐射消毒 适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的适用于消毒量大和不适于做高压或滤过的用品。用品。第19页

16、/共71页n n、湿热灭菌、湿热灭菌、湿热灭菌、湿热灭菌n n 湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌。菌。菌。菌。n n 各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，各种物品有效消毒灭菌压力和时

17、间不同，各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般培养用液、橡胶制品要求一般培养用液、橡胶制品要求一般培养用液、橡胶制品要求一般培养用液、橡胶制品要求1010磅磅磅磅(114(114)，10102020分钟或分钟或分钟或分钟或8 8磅磅磅磅(112(112)30)30分钟。布类、分钟。布类、分钟。布类、分钟。布类、玻璃制品、金属器械等为玻璃制品、金属器械等为玻璃制品、金属器械等为玻璃制品、金属器械等为1515磅磅磅磅(12(12l l)20)20分分分分钟钟钟钟。n n。第20页/共71页n n、干热灭菌、干热灭菌n n 主要适用于玻璃器皿的消主要适用于玻璃器

18、皿的消毒灭菌。用电热鼓风干燥箱加毒灭菌。用电热鼓风干燥箱加温到温到160，保持，保持1小时或更长小时或更长时间，可达到消毒目的。金属时间，可达到消毒目的。金属器械和橡胶、塑料制品不能使器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。用干热消毒法。n n 灼烧也属于干热消毒灭菌灼烧也属于干热消毒灭菌方法方法第21页/共71页、滤过除菌、滤过除菌 大大多多数数培培养养用用液液，如如人人工工合合成成培培养养液液、血血清清、酶酶溶溶液液等等，在在高高温温下下会会变变性性，失失去去功功能能，必必须须采采用用滤滤过法除菌。过法除菌。玻玻璃璃滤滤器器适适用用于于各各种种培培养养液液的的滤滤过过除除菌菌。玻玻璃璃滤滤

19、器器根根据据滤滤板板的的孔孔径径分分为为G1一一G6几几种种规规格格，一一般般采采用用G6型型(孔径在孔径在1.5m以下以下)，可达到除菌目的。，可达到除菌目的。微微孔孔滤滤膜膜滤滤器器，应应选选用用孔孔径径为为0.22m的的滤滤膜膜过过滤除菌。滤除菌。各各种种滤滤器器必必须须先先经经高高压压蒸蒸气气消消毒毒、烤烤干干后后方方可可使使用。用。第22页/共71页（二）化学消毒法（二）化学消毒法、消毒剂、消毒剂 细细胞胞培培养养室室的的工工作作面面、家家具具、墙墙壁壁、地地面面和和空空气气等等可可用用消消毒毒剂剂进进行行灭灭菌菌处处理理。如如：75酒酒精精常常用用于于皮皮肤肤和和瓶瓶皿皿开开口口部

20、部位位的的消消毒毒；0.1新新洁洁尔尔灭灭是是目目前前最最常常用用的的消消毒毒剂剂，可可以以对对器器械械、皮皮肤肤、操操作作面面进进行行擦擦拭拭和和浸浸泡泡消消毒毒；乳乳酸酸可可用用于于空空气气消消毒毒：来来苏苏儿儿可可用用于于地地面面消消毒毒；过过氧氧乙乙酸酸消消毒毒能能力力很很强强，在在0.5%的的浓浓度度下下，10min就就可可将将芽芽孢孢菌菌杀杀死死。甲甲醛醛是是一一种种光光谱谱灭灭菌菌剂剂，其其水水溶溶液液和和气气体体对对各各种种细细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。第23页/共71页n n、抗生素、抗生素、抗生素、抗生素n n抗生素主要适用于培

21、养用液消毒灭菌，不抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是为了预防。为了预防。为了预防。为了预防。n n 最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉素等。常规培养用液抗生素浓度为：青霉霉素等。常规培养用液抗生素浓度为：青霉霉素等。常规培养用液抗生素浓度为：青霉霉素等。常规培养

22、用液抗生素浓度为：青霉素素素素100100单位单位单位单位mlml、链霉素链霉素链霉素链霉素100100单位单位单位单位m1m1、庆大庆大庆大庆大霉素霉素霉素霉素5050ggm1m1或或或或l00gl00gm1m1。第24页/共71页六、污染检测与控制六、污染检测与控制 污污染染：一切与培养无关的杂质（微生物、化学物、细胞等）进入培养系统，影响培养物的正常生理机能。在众多的污染源中，微生物是最突出最重要最常见的污染。(一一)微生物污染的途径微生物污染的途径 空气、器材、操作、血清和组织样本等。第25页/共71页（二）污染对培养细胞的影响及检测（二）污染对培养细胞的影响及检测n n1 1、细菌的

23、污染检测与控制、细菌的污染检测与控制、细菌的污染检测与控制、细菌的污染检测与控制n n 当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，当受到细菌污染时，培养液很快颜色变黄，产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养产生大量酸性物质。显微镜下观察可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周液中有大量圆球状颗粒漂浮，细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、围有大量细菌存在，

24、细胞停止生长、中毒、围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、围有大量细菌存在，细胞停止生长、中毒、崩解死亡。崩解死亡。崩解死亡。崩解死亡。n n采用普通肉汤培养基也可以检测到污染。采用普通肉汤培养基也可以检测到污染。采用普通肉汤培养基也可以检测到污染。采用普通肉汤培养基也可以检测到污染。n n用青霉素、链霉素可预防细菌的污染用青霉素、链霉素可预防细菌的污染用青霉素、链霉素可预防细菌的污染用青霉素、链霉素可预防细菌的污染第26页/共71页n n2、真菌的污染检测与控制、真菌的污染检测与控制n n常见污染真菌有烟曲霉、黑曲常见污染真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母霉、毛霉菌、白念珠菌、酵母

25、菌等。在培养液表面会出现白菌等。在培养液表面会出现白色或浅黄色漂浮物。显微镜下色或浅黄色漂浮物。显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝。的丝状、管状及树枝状菌丝。n n可用抗真菌剂防止真菌污染。可用抗真菌剂防止真菌污染。n n 第27页/共71页n n3、支原体的污染检测与控制、支原体的污染检测与控制 支原体的污染是一个常见而支原体的污染是一个常见而棘手的问题，外观上看不出明棘手的问题，外观上看不出明显的变化，实际上或多或少的显的变化，实际上或多或少的影响到细胞的众多机能。目前影响到细胞的众多机能。目前尚无有效的防范措施。可通过尚无有效的防范措施。

26、可通过支原体培养、支原体培养、PCR及电镜观察及电镜观察等方法进行检测。等方法进行检测。n n支原体的去除可采用：支原体的去除可采用：41C41C 第28页/共71页n n4 4、病毒的污染检测与控制、病毒的污染检测与控制n n 病毒的污染主要是通过病毒的污染主要是通过DNADNA的整合，改变培养细胞的的整合，改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长生物学性状，影响细胞的生长或干预实验结果的准确性。或干预实验结果的准确性。n n 对病毒的检测主要有直接对病毒的检测主要有直接观察、动物接种检查、电镜观观察、动物接种检查、电镜观察、免疫学及察、免疫学及PCRPCR法。法。第29页/共71页n n5

27、、细胞交叉污染及检测、细胞交叉污染及检测n n 在培养的细胞中混杂有其它细胞，从而对培养的细胞产生形态或生长特性等方面的影响。常采用形态观察或检查细胞的标记物进行检测。n n 有效防治采取的措施：1）严格操作，器具分明，空间隔离；2）细胞的取放严禁接触培养液瓶口；3）对培养的细胞要有充足的储备。n n 第30页/共71页（三）污染的预防 1、培养操作前的准备(超净工作台的严格护理)2、培养操作时的注意事项 3、其他注意事项第31页/共71页七、无菌操作技术七、无菌操作技术（无菌操作的基本要领和要求）（无菌操作的基本要领和要求）n n在细胞培养中防止污染是决定培养成功或在细胞培养中防止污染是决定

28、培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。为达到这到最大限度的无菌，防止污染。为达到这一要求，所有工作要进行得有条不紊和安一要求，所有工作要进行得有条不紊和安全可靠。全可靠。第32页/共71页（一）培养前的准备（一）培养前的准备 要要充充分分做做好好培培养养前前的的实实验验用用品品准准备备工工作作，根根据据研研究究内内容容的的要要求求进进行行物物品品清清点点包包装装，注注明明标标签签后后灭灭菌菌、烤烤干干备备用用。在在工工作作前前移移入入超超净净工工作作台

29、内。台内。（二）培养室和超净工作台的消毒（二）培养室和超净工作台的消毒 工作面先用新洁尔灭擦拭一遍后，打开紫外工作面先用新洁尔灭擦拭一遍后，打开紫外线灯灭菌，用线灯灭菌，用30W紫外线灯管直接照射紫外线灯管直接照射2030分钟。然后关闭紫外灯，打开风机。分钟。然后关闭紫外灯，打开风机。超净工作超净工作台要用台要用75酒精擦拭。酒精擦拭。培养用液和培养细胞不培养用液和培养细胞不能放在紫外线下直接照射，在操作时随手携入。能放在紫外线下直接照射，在操作时随手携入。第33页/共71页（三）洗手和着装（三）洗手和着装 原原则则上上与与外外科科手手术术洗洗手手相相同同：先先用用肥肥皂皂刷刷洗洗手手和和前前

30、臂臂，再再用用流流水水冲冲洗洗，然然后后用用0.2新新洁洁尔尔灭灭或或75洒精棉球擦洗。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。洒精棉球擦洗。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。（四）无菌培养操作（四）无菌培养操作 在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行（管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行（火焰火焰消毒）消毒）。第34页/共71页 注意金属器械不能在火焰注意金属器械不能在火焰上烧灼时间过长，以防退火。上烧灼时间过长，以防退火。烧过的用具要待冷却

31、后才能挟烧过的用具要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。取组织，以免造成组织损伤。n n进行细胞培养操作时，动作要进行细胞培养操作时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。防空气流动，增加污染机会。n n 不能用手触及器皿的无菌部不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部。焰烧灼触及部。第35页/共71页 为为拿拿取取方方便便，工工作作台台面面上上的的布布局局要要合合理理，原原则则上上为为右右手手使使用用方方便便的的用用品品放放在在右右侧侧，左手用品在左侧。左手用品在左侧。培养液等不要过早开瓶，不要

32、长时间直培养液等不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。立暴露开口，以免增加污染机会。吸取不同用液时，均应分别使用不同的吸取不同用液时，均应分别使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。的机会。第36页/共71页八、显微技术八、显微技术n n各种显微镜技术n n同细胞生物学要掌握原理与应用第37页/共71页九、细胞观察与分析九、细胞观察与分析九、细胞观察与分析九、细胞观察与分析n n细胞在培养过程中，要及时观察和了解生细胞在培养过程中，要及时观察和了解生长增殖状况，包括新生、增殖、消亡等各长增殖状况，包括新生、增殖、消亡等各种状态

33、的时间参数、细胞数量、分布位置种状态的时间参数、细胞数量、分布位置等指标，以及体外因素对这些指标的调节等指标，以及体外因素对这些指标的调节机制。这属于细胞动力学的研究。广义的机制。这属于细胞动力学的研究。广义的细胞动力学还包括其它的细胞运动及其原细胞动力学还包括其它的细胞运动及其原理的研究。理的研究。第38页/共71页（一）细胞技术与活力分析（一）细胞技术与活力分析n n1 1、细胞计数法、细胞计数法、细胞计数法、细胞计数法n n 用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，然后根据需要进行必要的调整。然后根据需要进行必要的调整。n n n n2 2、细胞生长曲

34、线、细胞生长曲线、细胞生长曲线、细胞生长曲线n n 生长曲线是反映培养细胞的时间与培养细生长曲线是反映培养细胞的时间与培养细胞浓度之间关系的曲线。以时间（横坐标）胞浓度之间关系的曲线。以时间（横坐标）对细胞浓度（细胞数对细胞浓度（细胞数/ml/ml为纵坐标）绘制，反为纵坐标）绘制，反映培养过程中细胞生长与死亡的动态变化。映培养过程中细胞生长与死亡的动态变化。第39页/共71页3、有丝分裂指数的测定、有丝分裂指数的测定 在一群细胞中，进入分裂期细胞所占该群细胞的百分率，即为有丝分裂指数。它反映了细胞增殖的速度。分裂细胞数 分裂指数 =100%细胞总数4、细胞贴壁率、细胞贴壁率 又又称接种存活率，

35、贴壁附着生长的细胞状况直接反映细胞的生存能力。第40页/共71页5、流式细胞仪检测细胞周期、流式细胞仪检测细胞周期 细胞周期各时相控制并按一定的时间顺序予以表达的，而细胞周期各时相的分析，特别是细胞周期及其各时相时长的测定对于研究细胞群体的生长行为，尤其是对于包括DNA复制、细胞分裂在内的细胞增殖调节控制的研究，无疑是一个很重要的前提。第41页/共71页基本步骤基本步骤基本步骤基本步骤n n细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养n n消化细胞计数消化细胞计数消化细胞计数消化细胞计数n n种植种植种植种植60 mm 60 mm 培养皿（培养皿（培养皿（培养皿（70 X1070 X104 个细胞个细胞个

36、细胞个细胞/皿）皿）皿）皿）n n药物处理细胞药物处理细胞药物处理细胞药物处理细胞n n收细胞（胰蛋白酶消化收细胞（胰蛋白酶消化收细胞（胰蛋白酶消化收细胞（胰蛋白酶消化-培养基终止）培养基终止）培养基终止）培养基终止）n n20002000转转转转/分分分分 离心离心离心离心 10min10minn n去上清液去上清液去上清液去上清液PBSPBS重悬，重复重悬，重复重悬，重复重悬，重复6 6的步骤的步骤的步骤的步骤n n去上清加入去上清加入去上清加入去上清加入100 ul 1mg/mlPI 100 ul 1mg/mlPI 和和和和100ul 1mg/ml 100ul 1mg/ml RNase

37、A,RNase A,避光处理避光处理避光处理避光处理30min30minn n流式细胞仪检测流式细胞仪检测流式细胞仪检测流式细胞仪检测第42页/共71页第43页/共71页6、MTT比色法测定细胞活力比色法测定细胞活力 活细胞表现出线粒体脱氢酶活性，可将染料MTT还原为难溶的紫色结晶物沉积在细胞内，经酸性异丙醇溶解后呈现的色度可反映出生活细胞的代谢水平。而死细胞则无此酶活性。第44页/共71页n nMTTMTT检测细胞存活率检测细胞存活率检测细胞存活率检测细胞存活率n n基本步骤基本步骤基本步骤基本步骤n n细胞培养细胞培养细胞培养细胞培养n n消化细胞计数消化细胞计数消化细胞计数消化细胞计数n

38、 n种植种植种植种植9696孔板（孔板（孔板（孔板（110X 103 110X 103 个细胞个细胞个细胞个细胞/孔）孔）孔）孔）n n药物处理细胞，结束药物处理细胞，结束药物处理细胞，结束药物处理细胞，结束4 4小时前每孔加入小时前每孔加入小时前每孔加入小时前每孔加入20 ul 5 20 ul 5 mg/ml MTTmg/ml MTTn n弃上清，每孔加弃上清，每孔加弃上清，每孔加弃上清，每孔加100 ul DMSO100 ul DMSOn n560 nm 560 nm 检测检测检测检测n nViability(%)=OD560,TV/OD560,control Viability(%)=O

39、D560,TV/OD560,control 100100第45页/共71页第46页/共71页n n7 7、成集落实验（、成集落实验（、成集落实验（、成集落实验（Colong-forming testColong-forming test）n n 在集落刺激因子存在下培养细胞，可刺激在集落刺激因子存在下培养细胞，可刺激培养细胞分化产生大小不同的细胞集落，这培养细胞分化产生大小不同的细胞集落，这样的集落形成细胞称体外培养集落形成细胞，样的集落形成细胞称体外培养集落形成细胞，它是检验培养细胞能否增殖的过硬指标之一。它是检验培养细胞能否增殖的过硬指标之一。n n 平均集落数平均集落数n n 集落形成率

40、集落形成率 =100%=100%n n 接种的单个细胞数接种的单个细胞数第47页/共71页（二）细胞固定与染色观察（二）细胞固定与染色观察n n1 1、细胞固定、细胞固定、细胞固定、细胞固定n n2 2、细胞染色、细胞染色、细胞染色、细胞染色 H.EH.E（苏木精（苏木精（苏木精（苏木精-伊红）：样品制备、染细胞伊红）：样品制备、染细胞伊红）：样品制备、染细胞伊红）：样品制备、染细胞核、染细胞质、脱水、透明和封片。核、染细胞质、脱水、透明和封片。核、染细胞质、脱水、透明和封片。核、染细胞质、脱水、透明和封片。GiemsaGiemsa染色法：细胞核或染色体染成紫红染色法：细胞核或染色体染成紫红染

41、色法：细胞核或染色体染成紫红染色法：细胞核或染色体染成紫红色或蓝紫色，细胞质染成粉红色。色或蓝紫色，细胞质染成粉红色。色或蓝紫色，细胞质染成粉红色。色或蓝紫色，细胞质染成粉红色。Feulgen Feulgen染色法：染色法：染色法：染色法：考马斯亮蓝染色法：细胞骨架考马斯亮蓝染色法：细胞骨架考马斯亮蓝染色法：细胞骨架考马斯亮蓝染色法：细胞骨架。第48页/共71页n n 免疫荧光染色免疫荧光染色n n 免疫过氧化物酶染色法免疫过氧化物酶染色法第49页/共71页3、细胞培养中常用的染色方法、细胞培养中常用的染色方法n n活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活活

42、体染色：在体外条件下用某种染色剂对活活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色的组织或细胞进行染色的组织或细胞进行染色的组织或细胞进行染色,而对活细胞的生理活而对活细胞的生理活而对活细胞的生理活而对活细胞的生理活动不产生任何明显的影响。动不产生任何明显的影响。动不产生任何明显的影响。动不产生任何明显的影响。n n 用于活体染色的染料称为活体染料或活体用于活体染色的染料称为活体染料或活体用于活体染色的染料称为活体染料或活体用于活体染色的染料称为活体染料或活体染色剂，分为碱性和酸性两类：染色剂，分为碱性和酸性两类：染色剂，分为碱性和酸性两类：染色剂，分为碱性和酸性两类：n n 碱性

43、活体染料：次甲基蓝、中性红、詹纳碱性活体染料：次甲基蓝、中性红、詹纳碱性活体染料：次甲基蓝、中性红、詹纳碱性活体染料：次甲基蓝、中性红、詹纳斯绿、甲基紫等，常用于体外活体染色。斯绿、甲基紫等，常用于体外活体染色。斯绿、甲基紫等，常用于体外活体染色。斯绿、甲基紫等，常用于体外活体染色。n n 酸性活体染料：台盼蓝、刚果红等，只用酸性活体染料：台盼蓝、刚果红等，只用酸性活体染料：台盼蓝、刚果红等，只用酸性活体染料：台盼蓝、刚果红等，只用于体内活体染色，体外活细胞难以着色。于体内活体染色，体外活细胞难以着色。于体内活体染色，体外活细胞难以着色。于体内活体染色，体外活细胞难以着色。第50页/共71页n

44、 n 活体染色方法活体染色方法活体染色方法活体染色方法n n1 1）台盼蓝染色）台盼蓝染色）台盼蓝染色）台盼蓝染色n n 活细胞不着色，死细胞染上兰色。活细胞不着色，死细胞染上兰色。活细胞不着色，死细胞染上兰色。活细胞不着色，死细胞染上兰色。n n2 2）吖啶橙荧光染色法）吖啶橙荧光染色法）吖啶橙荧光染色法）吖啶橙荧光染色法n n 直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞。直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞。直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞。直接染色观察活细胞或固定染色观察细胞。n n 吖啶橙是一种与吖啶橙是一种与吖啶橙是一种与吖啶橙是一种与DNADNA和和和和RNARNA都能结合的荧都能结

45、合的荧都能结合的荧都能结合的荧光染料，在蓝光或紫外光激发下，原来的活细光染料，在蓝光或紫外光激发下，原来的活细光染料，在蓝光或紫外光激发下，原来的活细光染料，在蓝光或紫外光激发下，原来的活细胞，其核呈亮绿色，核仁、胞，其核呈亮绿色，核仁、胞，其核呈亮绿色，核仁、胞，其核呈亮绿色，核仁、RNARNA呈桔红色，呈桔红色，呈桔红色，呈桔红色，胞质呈淡红褐色。而原来是已经死亡的细胞，胞质呈淡红褐色。而原来是已经死亡的细胞，胞质呈淡红褐色。而原来是已经死亡的细胞，胞质呈淡红褐色。而原来是已经死亡的细胞，核呈暗绿色，胞质呈亮铜色。核呈暗绿色，胞质呈亮铜色。核呈暗绿色，胞质呈亮铜色。核呈暗绿色，胞质呈亮铜色

46、。第51页/共71页n n 染色排除检测法染色排除检测法染色排除检测法染色排除检测法 n n 以死细胞和活细胞对色素的不同吸附来鉴别。以死细胞和活细胞对色素的不同吸附来鉴别。以死细胞和活细胞对色素的不同吸附来鉴别。以死细胞和活细胞对色素的不同吸附来鉴别。死细胞的细胞膜透性发生变化，染料大量进入而死细胞的细胞膜透性发生变化，染料大量进入而死细胞的细胞膜透性发生变化，染料大量进入而死细胞的细胞膜透性发生变化，染料大量进入而不能排出，因此而着色。而活细胞能及时排出进不能排出，因此而着色。而活细胞能及时排出进不能排出，因此而着色。而活细胞能及时排出进不能排出，因此而着色。而活细胞能及时排出进入细胞的染

47、料或染料不能进入活细胞，故不着色。入细胞的染料或染料不能进入活细胞，故不着色。入细胞的染料或染料不能进入活细胞，故不着色。入细胞的染料或染料不能进入活细胞，故不着色。n n 这类染料大多为酸性染料，主要有：台盼蓝、这类染料大多为酸性染料，主要有：台盼蓝、这类染料大多为酸性染料，主要有：台盼蓝、这类染料大多为酸性染料，主要有：台盼蓝、苯胺黑、赤藓红苯胺黑、赤藓红苯胺黑、赤藓红苯胺黑、赤藓红B B、伊红、伊红、伊红、伊红Y Y等。等。等。等。n n1 1、台盼蓝排除检测法、台盼蓝排除检测法、台盼蓝排除检测法、台盼蓝排除检测法 n n2 2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法

48、、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法n n EBEB和和和和PIPI均为荧光染料，可特异与均为荧光染料，可特异与均为荧光染料，可特异与均为荧光染料，可特异与DNADNA结合。发结合。发结合。发结合。发橙红色荧光的为死细胞。橙红色荧光的为死细胞。橙红色荧光的为死细胞。橙红色荧光的为死细胞。第52页/共71页（四）凋亡细胞的观察（四）凋亡细胞的观察n n细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞死亡方式，是在一定的生理或病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，激活内源性核酸内切酶而发生的细胞自动消亡的过程，亦称为程序化细胞死 亡(programmed cell death

49、，PCD)第53页/共71页形态学检测形态学检测形态学检测形态学检测n n光学显微镜观察光学显微镜观察光学显微镜观察光学显微镜观察 样品涂片或组织切片经常规处理、样品涂片或组织切片经常规处理、样品涂片或组织切片经常规处理、样品涂片或组织切片经常规处理、HEHE染色后，染色后，染色后，染色后，即可放在油镜下观察。该方法简便，缺点是即可放在油镜下观察。该方法简便，缺点是即可放在油镜下观察。该方法简便，缺点是即可放在油镜下观察。该方法简便，缺点是只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能只有在发现了具有特征性的凋亡小体时才能确定

50、为阳性，因而不易检出早期的凋亡细胞，确定为阳性，因而不易检出早期的凋亡细胞，确定为阳性，因而不易检出早期的凋亡细胞，确定为阳性，因而不易检出早期的凋亡细胞，而且某些类型的细胞坏死而且某些类型的细胞坏死而且某些类型的细胞坏死而且某些类型的细胞坏死(如凝固性坏死如凝固性坏死如凝固性坏死如凝固性坏死)与细与细与细与细胞凋亡形态相似，两者不易区分。因此，该胞凋亡形态相似，两者不易区分。因此，该胞凋亡形态相似，两者不易区分。因此，该胞凋亡形态相似，两者不易区分。因此，该方法只能作为细胞凋亡初步推测的基础，不方法只能作为细胞凋亡初步推测的基础，不方法只能作为细胞凋亡初步推测的基础，不方法只能作为细胞凋亡初