最新课件单克隆抗体.pptx

《最新课件单克隆抗体.pptx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《最新课件单克隆抗体.pptx（64页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、杂交瘤技术的诞生1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国自然杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）1984年度荣获诺贝尔生理学和医学奖第1页/共64页 一、一、杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆化增殖的杂交瘤细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效价的单克隆抗

2、体第2页/共64页抗体种类：第一代抗体 多克隆抗体 （polyclonalantibody)第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody)第3页/共64页B淋巴细胞:寿命短,分泌特异系性抗体骨髓瘤细胞：寿命长杂交瘤细胞：寿命长，单 隆抗体第4页/共64页流程第5页/共64页 不产生Ig的重链和轻链HGPRT-;TK-与提供淋巴细胞的动物品系相同（一）小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠建立的骨髓瘤细胞系:SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653

3、NSO/1第6页/共64页动物：BALB/c小鼠48周龄20g25g体重（二）免疫脾细胞第7页/共64页细胞性抗原：（12）107/只，不加佐剂，23周重复一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加强免疫体内免疫法-免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了免疫小鼠第8页/共64页。淋巴细胞第9页/共64页。浆细胞第10页/共64页。抗原接种第11页/共64页免疫原特性免疫原特性抗原量抗原量接种次数接种次数间隔时间隔时间间单抗的特性单抗的特性抗体滴度抗体滴度亲和性亲和性免疫原性强免疫原性强（如细

4、胞、细（如细胞、细菌和病毒等）菌和病毒等）10106 6-10-107 7个细胞个细胞或或1-10ug1-10ug2-42-42-42-4周周高高中等至强中等至强免疫原性中等免疫原性中等10-100ug10-100ug2-42-42-42-4周周中等或高中等或高中等或强中等或强免疫原性弱免疫原性弱A.20-400ugA.20-400ug2-42-4随后随后2-32-3每月每月2-32-3月月中等中等强强B.10-50ugB.10-50ug其后其后200-400ug200-400ug2 2其后其后4 4每月每月每天每天中等中等中等中等C.10-100ugC.10-100ug2 2其后其后4 4其

5、后其后“休息休息”最后加强最后加强每月每月1010天天1-21-2月月中等中等中等或强中等或强表6-1不同免疫抗原的免疫程序（引自刘秀梵，1994）第12页/共64页培养液：RPM1640培养液DMEM培养液（三）细胞融合第13页/共64页细胞融合剂：PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题第14页/共64页培养骨髓瘤细胞：选择对数生长期的细胞进行传代培

6、养细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80或液氮及干冰中第15页/共64页取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分钟通常每只小鼠1108-2.5108个脾细胞，每只大鼠脾脏可得5108-10108脾细胞。免疫脾细胞的制备：1108的淋巴细胞 无菌手术第16页/共64页常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞其中MQ还有清除死亡细胞的作用饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化在细胞融合后选择性培养过程中，由

7、于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞（Feedercells）。饲养细胞：第17页/共64页。饲养细胞第18页/共64页融合方法a、将1108脾细胞与2107-5107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。b、1000r/min离心5-10分钟，将上清尽量吸净。c、在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;置40水浴中预热。d、用1ml吸管在1分钟左右（最佳时间为45秒）加预热至40的50%PEG（PH8.0）1ml，边加边轻轻搅拌。

8、e、用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37的不完全培养基；20-37静置10分钟。f、1000r/min5分钟；弃去上清。g、加入5mlHAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。h、分装96孔细胞培养板，每孔0.10-0.15ml；分装24孔板，每孔1.0-1.5ml；然后将培养板置37，6%CO2培养箱内培养。i、5天后用HAT培养基换出1/2培养基。j、7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；（第14天后可用普通完全培养基）。l、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。第19页

9、/共64页1020天出现克隆HAT筛选杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。融合细胞的早期培养第20页/共64页常用的抗体检测方法：（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性高，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。用可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）用全菌抗原的ELISA用全细胞抗原的ELISA抗体捕捉ELISA试验ABC-ELISA试验Dot-ELISA试验免疫组化染色法（2）免疫荧光技术间接免疫荧光法活细胞的膜荧光染色（3）间接血凝试验（4

10、）放射免疫测定第21页/共64页HGPRT酶与TK酶：次黄嘌呤磷酸核糖转化酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）杂交瘤细胞的选择性培养应用液：8-氮杂鸟嘌呤 聚乙二醇第22页/共64页HAT培养基：H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA第23页/共64页HAT选择作用：淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻第24页/共64页SP2/O:HGPRT-，TK-

11、;长命脾细胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)杂交瘤细胞:HGPRT+，TK+;长命骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞第25页/共64页杂交瘤细胞：长期生长繁殖利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力第26页/共64页有限稀释法(limitingdilution)FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）软琼脂平板法(softagarmethod)二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存第27页/共64页特点：不需任何特殊设备克隆出现效率高实验室常用方法方法：细胞悬液通过系列

12、稀释每个培养孔含0.51个细胞有限稀释法每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。第28页/共64页效率最高价格昂贵FACS第29页/共64页软琼脂平板法(softagarmethod)37、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。第30页/共64页配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml)+细胞冻存液(30%40%牛血清，50%60%RPMI-1640培养液，10%DMSO)“慢冻”：分步冷冻

13、，30-70液氮保存数年至数十年“快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防止实验室可能发生的意外事故第31页/共64页防止污染避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义第32页/共64页（1）单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。A、杂交瘤细胞的染色体分析 对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂

14、交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-56；B、单抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定免疫扩散ELISAC、单抗纯度的鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB（三）单克隆抗体的性质鉴定第33页/共64页（2）单抗理化特性的鉴定抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的程度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲

15、合力通常以平均内在结合常数（K）表示。常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA、间接ELISA、间接法夹心ELISA等（3）单抗与相应抗原的反应性测定包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等第34页/共64页三、单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩大培养（除及时冻存的细胞外）。因多次传代易引起染色体逐渐丢失而使细胞产生抗体能力逐渐减弱甚至消失，还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体。第35页/共64页（一）单克隆抗体的产生1 动物体内诱生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（510）105/只,使用的动物当然首选BALB/c小鼠,将

16、杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig）第36页/共64页腹腔注射法第37页/共64页2 体外培养法：a、悬浮培养法：小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器b、微载体培养法Microcarrier：主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品c、中空纤维细胞培养系统：由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成d、微囊化细胞培养系统：先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于

17、培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。第38页/共64页（3）杂交瘤细胞的无血清培养已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；第39页/共64页可溶性抗原：ELISA抗体捕获法细胞、亚细胞结构上的抗原：免疫荧光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定细胞）（二）单克隆抗体的纯化第40页/共64页前5天进行,预先腹腔注射pristane（15）10

18、6细胞13w形成腹水腹水型单抗的纯化高滴度腹水第41页/共64页盐析沉淀亲和层析离子交换层析 McAb的纯化 第42页/共64页ELISA多头加样枪第43页/共64页ELISA第44页/共64页。免疫荧光法第45页/共64页（四）单克隆抗体的特性高度特异性高度特异性高度的均一性和可重复性高度的均一性和可重复性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应弱凝集反应和不呈现沉淀反应对环境敏感性对环境敏感性第46页/共64页优点优点 ：在体外在体外“永久永久”地存活并传代地存活并传代用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法

19、体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗（五）单克隆抗体的优点与局限性局限性局限性 ：固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围反应强度不如多克隆抗体反应强度不如多克隆抗体制备技术复杂、费时费工、价格较高制备技术复杂、费时费工、价格较高第47页/共64页 McAb PcAb 抗原要求 可以不纯 纯度高得量 高 低特异性 高 低 稳定 低 高 沉淀反应 无 有成本 高 低McAb与PcAb的比较第48页/共64页三、基因工程抗体制备三、基因工程抗体制备基因工程抗体(Ge

20、neticengineeringantibody)根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。第49页/共64页 将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体（一）人源化抗体第50页/共64页方法：从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力1、嵌合抗体第51页/共64页

21、嵌合抗体第52页/共64页定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。RAb亦叫“重构型抗体”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可称为“CDR移植抗体意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗2、改型抗体第53页/共64页Fab：抗原结合片断Fv：可变区片段ScFv：单链可变区片段SdAb：单区抗体 （二）小分子抗体第54页/共64页小分子抗体第55页/共64页其它生物活性蛋白融合（三）抗体融合蛋白第56页/共64页 许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位

22、交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。（四）双特异性抗体第57页/共64页 分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。化学交联BsAb第58页/共64页 将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤(quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%50%不等。多倍杂

23、交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应(HAMA)，因此不适用于临床。细胞工程BsAb第59页/共64页 多采用抗体分子片段多采用抗体分子片段,如如FabFab，FvFv或或ScFv,ScFv,经基因操作修饰后经基因操作修饰后,或体或体外组装为外组装为BsAb,BsAb,或直接表达分泌型或直接表达分泌型的的BsAbBsAb。基因工程BsAb第60页/共64页定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性（五）噬菌体抗体库技术第61页/共64页用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人（一）基本原理和程序第62页/共64页噬菌体抗体库第63页/共64页感谢您的观看。第64页/共64页