基因工程学时PPT讲稿.ppt

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1、基因工程学时第1页，共26页，编辑于2022年，星期六基因工程概念：基因工程概念：应用人工方法把生物的遗传物质（应用人工方法把生物的遗传物质（DNADNA）分离出来，）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组的在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组的DNADNA导入某种宿导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；或者使新的遗传主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；或者使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。（多肽或蛋白质）。第2页，共26页，编辑于2022年，星期六2基因工程技术的一般步骤基因

2、工程技术的一般步骤第3页，共26页，编辑于2022年，星期六3n第一节第一节 基因工程理论的研究基础基因工程理论的研究基础n第二节第二节 基因工程基本技术路线基因工程基本技术路线n第三节第三节 常用的工具酶和载体常用的工具酶和载体n第四节第四节 目的基因片段的获取目的基因片段的获取n第五节第五节 目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞n第六节第六节 克隆子的筛选和鉴定克隆子的筛选和鉴定第4页，共26页，编辑于2022年，星期六4第一节第一节 基因工程理论的研究基础基因工程理论的研究基础染色体是遗传物质的载体。染色体是遗传物质的载体。“基因基因”一词的创立：一词的创立：19091909年，丹麦

3、遗传学家约翰年，丹麦遗传学家约翰逊提出了逊提出了“基因基因”（genegene）一词。）一词。“基因型基因型”与与“表现型表现型”术语，初步阐明基因与性状的关系。术语，初步阐明基因与性状的关系。不过此时的基因仍是一个未经证实，仅靠逻辑不过此时的基因仍是一个未经证实，仅靠逻辑推理得出的概念。推理得出的概念。第5页，共26页，编辑于2022年，星期六5基因结构示意图基因结构示意图链链5链链3上游上游 3 5第6页，共26页，编辑于2022年，星期六6基因工程研究的理论依据：基因工程研究的理论依据：n不同基因具有相同的物质基础不同基因具有相同的物质基础n基因是可以切割的基因是可以切割的n基因是可以转

4、移的基因是可以转移的n多肽与基因之间存在对应关系多肽与基因之间存在对应关系n遗传密码是通用的遗传密码是通用的n基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代第7页，共26页，编辑于2022年，星期六7第二节第二节 基因工程的一般步骤基因工程的一般步骤生物材料生物材料生物材料生物材料RNARNARNARNADNADNADNADNAmRNAmRNAmRNAmRNAcDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库人工合成人工合成人工合成人工合成目的基因目的基因目的基因目的基因克隆载体克隆载体克隆载体克隆载体重组重组重组重组DNAD

5、NADNADNA受体细胞受体细胞受体细胞受体细胞克隆子克隆子克隆子克隆子转基因生物转基因生物转基因生物转基因生物第8页，共26页，编辑于2022年，星期六8第三节第三节 常常用用的工具酶和载体的工具酶和载体 3.1 3.1 工具酶工具酶（一）限制性核酸内切酶：（一）限制性核酸内切酶：(二）二）DNADNA连接酶：连接酶：（三）（三）DNADNA片段末端修饰酶：片段末端修饰酶：(四四)DNA)DNA聚合酶聚合酶第9页，共26页，编辑于2022年，星期六9(一一)限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（Restriction endonucleaseRestriction endonuclease）（1

6、）限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶定义一类以环形或线形双链一类以环形或线形双链DNADNA为底物，能识别为底物，能识别DNADNA中特定中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具有酯键断开，产生具有33OHOH和和55P P基团基团DNADNA片段的内片段的内脱氧核苷酸酶。脱氧核苷酸酶。第10页，共26页，编辑于2022年，星期六10 （2 2）限制性核酸内切酶种类）限制性核酸内切酶种类I I型酶：它们在识别位点很远的地方任意切割型酶：它们在识别位点很远的地方任意切割DNADNA链链 IIII型酶：在其识别位点

7、之中或临近的确定位点特异地切开型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNADNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带 IIIIII型酶：它们在识别位点之外切开型酶：它们在识别位点之外切开DNADNA链，并且要求识别位点是链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备反向重复序列；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。实用价值，也没有人将其商业化。第11页，共26页，编辑于2022年，星期六11根据分离此酶微生物的学名，一般取根据分离此酶微生物的学名，一般取3 3个字母。个字母。第一个字母

8、大写第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写第二、三个字母小写 该微生物种名前的该微生物种名前的2 2个字母个字母第四个字母大写第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母有变种或品系的第一个字母罗罗马马字字母母、从从一一种种微微生生物物中中发发现现了了几几种种 限制酶，按发现顺序排列限制酶，按发现顺序排列 如如E EcocoRR是是指指从从大大肠肠杆杆菌菌（Escherichia Escherichia colicoli）R R株分离得到的第一种限制酶。株分离得到的第一种限制酶。（3）限制性核酸内切酶的命名）限制性核酸内切酶的命名第12页，共26页，

9、编辑于2022年，星期六12nnH i n d IIIH i n d IIInnHaemophilus influenzaeHaemophilus influenzae d d属名 种名 株名嗜血流感杆菌d株发现的第三种限制性内切酶第13页，共26页，编辑于2022年，星期六13 （4 4）限制性内切酶作用模式图：）限制性内切酶作用模式图：（a)a)产生产生55突出突出粘性末端粘性末端(sticky end)(sticky end)EcoR I*GAATTC*CTTAAG*55335533*G*C T T A A 55333355OHP A A T T C*G*55333355P OH第14页

10、，共26页，编辑于2022年，星期六14 (b(b）产生产生33突出突出粘性末端粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*5533553355333355OHP*C T G C A*G55333355OHPA C G T C*G*第15页，共26页，编辑于2022年，星期六15 (c(c）产生产生平末端平末端(blunt endblunt end)Alu I*AGCT*TCGA*5533553355333355OHP*AG*TC55333355 OHPCT*GA*第16页，共26页，编辑于2022年，星期六16常用的限制性内切酶Rsa I GT AC CA TG BamH I G GAT

11、C C C CTAG GNot I GC GGCC GC CG CCGG CGEcoR V GAT ATC CTA TAG53第17页，共26页，编辑于2022年，星期六17n(6)(6)常用的酶切方法：常用的酶切方法：单酶切 双酶切 部分酶切：底物浓度低，识别序列的甲基化，酶用量不足，反应时间不够以及反应缓冲液n(5)(5)酶切反应体系酶切反应体系第18页，共26页，编辑于2022年，星期六18（二）（二）DNA连接酶连接酶 DNADNA连连接接酶酶是是基基因因工工程程第第二二位位重重要要的的工工具酶。具酶。催催化化两两个个dsDNAdsDNA分分子子的的粘粘性性末末端端或或平平头头末端末端

12、33OHOH、55P P连接作用。连接作用。第19页，共26页，编辑于2022年，星期六19(1)DNA片段之间的连接n（a a）具有互补粘性末端片段之间的连接：）具有互补粘性末端片段之间的连接：T4 DNAT4 DNA连接酶或连接酶或E.coliE.coli DNA DNA连接酶连接酶 n（b b）具有平末端）具有平末端DNADNA片段之间的连接：片段之间的连接：T4 DNAT4 DNA连接酶；连接酶；第20页，共26页，编辑于2022年，星期六20n（c c）DNADNA片段末端修饰后进行连接片段末端修饰后进行连接：核酸外切酶：切成平末端核酸外切酶：切成平末端 末端转移酶：修饰成互补黏性末

13、端末端转移酶：修饰成互补黏性末端 碱性磷酸酶：将碱性磷酸酶：将5-P5-P修饰成修饰成5-5-OHOHn（d d）DNADNA片段加连杆后连接片段加连杆后连接 人工合成连杆或衔接头人工合成连杆或衔接头第21页，共26页，编辑于2022年，星期六21 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C*G*5335 P OHDNA连接酶连接酶（2）作用模式图：）作用模式图：a）连接粘性末端粘性末端第22页，共26页，编辑于2022年，星期六22 b b）连接平末端平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335*TC*AG53

14、35 OHPCT*GA*T4 DNA连接酶连接酶第23页，共26页，编辑于2022年，星期六23（三）（三）DNA片段末端修饰酶片段末端修饰酶*末端脱氧核苷酸转移酶：末端脱氧核苷酸转移酶：使使DNADNA片段平末端的片段平末端的3-3-OHOH加上同聚核苷酸，产生具有加上同聚核苷酸，产生具有polypoly(A(A、T T、G G、C)C)的粘性末端，通过的粘性末端，通过DNADNA连接酶的作用而完成连接酶的作用而完成DNADNA片段和载体间的连接片段和载体间的连接*核酸外切酶：核酸外切酶：切去切去DNADNA片段的凸出末端，使成为平末端片段的凸出末端，使成为平末端*碱性磷酸酶：碱性磷酸酶：为

15、防止为防止DNADNA片段末端之间的连接，常采用碱性片段末端之间的连接，常采用碱性磷酸酶处理，使磷酸酶处理，使DNADNA末端的末端的55P P成为成为5-5-OH.OH.第24页，共26页，编辑于2022年，星期六24（四）（四）DNA聚合酶聚合酶n（1）要有底物4种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA;n（2）必须有模版；n（3）需有引物，不能自行其起始合成新的DNA链；n（4）催化dNTP加到生长中的DNA链的3OH末端，DNA的合成方向是5 3。nPCR反应第25页，共26页，编辑于2022年，星期六25小结：小结：n n1.1.基因克隆（基因克隆（DNADNA重组）的基本流程重组）的基本流程n n2.2.常用工具酶：限制性核酸内切酶及其作常用工具酶：限制性核酸内切酶及其作用；用；DNADNA连接酶种类及其作用；连接酶种类及其作用；DNADNA末端修末端修饰酶（末端转移酶、核酸外切酶、碱性磷饰酶（末端转移酶、核酸外切酶、碱性磷酸酶等及其作用）酸酶等及其作用）第26页，共26页，编辑于2022年，星期六26