第三章 高效液相色谱分析精选PPT.ppt

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1、第三章第三章 高效液相色谱分析高效液相色谱分析2023/4/202023/4/20第1页，本讲稿共42页3-1 3-1 高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法：高效液相色谱法：一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱它在经典液相色谱的基础上，引入气相色谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、高的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、高灵敏度检测器。灵敏度检测器。第2页，本讲稿共42页第3页，本讲稿共42页1.1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压：高压：HP

2、LCHPLC采用高压输液设备采用高压输液设备,150-350*10150-350*105 5 PaPa 高速：高速：HPLCHPLC流速大增，分析速度极快，只需数分钟；而流速大增，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需数小时。经典方法靠重力加料，完成一次分析需数小时。高效：高效：化学键和固定相化学键和固定相,3000030000塔板塔板/米米 高灵敏：高灵敏：1010-9-9g g（紫外检测）、（紫外检测）、1010-11-11g g（荧光检测）（荧光检测）第4页，本讲稿共42页2 2、HPLCHPLC与与GCGC的区别的区别分析对象及范围分析对象及范围：GCGC分析只

3、限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只点有机物总数的有机物总数的20%20%；HPLCHPLC可以分析高沸点、高分子量、热稳定或不稳定可以分析高沸点、高分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的化合物，这类物质占有机物总数的80%80%。流动相的选择流动相的选择：GCGC采用的流动相中为有限的几种采用的流动相中为有限的几种“惰性惰性”气体，只起运载作气体，只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；用，和组分之间没有相互的作用力；HPLCHPLC采用的流动相为各种极性不同采用的流动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多

4、。它除了起运载作用外，还可的液体或液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度操作温度：GCGC需高温；需高温；HPLCHPLC通常在室温下进行。通常在室温下进行。第5页，本讲稿共42页 3-2 3-2 高效液相色谱法理论基础高效液相色谱法理论基础1.速率理论速率理论 P69 =2l l dp+Cd Dmu+Cm dP2 CSmdP2 Cs df2Dm Dm Ds+uH=A+CuBu

5、 由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：由于柱内色谱峰扩展所引起的塔板高度的变化为：第6页，本讲稿共42页速率方程：速率方程：H=A+B/u+Cu（1 1）液液体体的的扩扩散散系系数数仅仅为为气气体体的的万万分分之之一一，HPLCHPLC中中速速率率方程中的方程中的分子扩散项分子扩散项分子扩散项分子扩散项B/UB/U较小，可以忽略不计，较小，可以忽略不计，（2 2）影响柱效的主要因素是）影响柱效的主要因素是传质项。传质项。传质项。传质项。第7页，本讲稿共42页2、提高柱效的途径：、提高柱效的途径：提高

6、柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择薄壳提高柱内填料均匀性，减小固定相粒度（选择薄壳形担体）形担体）选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流动相粘选用低粘度的流动相或适当提高柱温，降低流动相粘度度;减小粒度是最有效的途径减小粒度是最有效的途径.第8页，本讲稿共42页3-3 3-3 高效液相色谱法高效液相色谱法主要类型及分离原理主要类型及分离原理1 1 1 1、液液分配色谱法、液液分配色谱法、液液分配色谱法、液液分配色谱法2 2 2 2、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法、液固吸附色谱法3 3 3 3、离子交换色谱法、离子交换色谱法、离子交换色谱法、离子交换色谱法4 4 4 4、离子

7、对色谱、离子对色谱、离子对色谱、离子对色谱5 5 5 5、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法、空间排阻色谱法 第9页，本讲稿共42页1 1、液液-液分配色谱液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；：组分在固定相和流动相上的分配；流流流流动动动动相相相相：对对对对于于于于亲亲亲亲水水水水性性性性固固固固定定定定液液液液，采采采采用用用用疏疏疏疏

8、水水水水性性性性流流流流动动动动相相相相，即即即即流流流流动动动动相相相相的的的的极极极极性性性性小小小小于于于于固固固固定定定定液液液液的的的的极极极极性性性性（正正正正相相相相 ），反反反反之之之之，流流流流动动动动相相相相的的的的极极极极性性性性大大大大于于于于固定液的极性（固定液的极性（固定液的极性（固定液的极性（反相反相反相反相 ）。）。）。）。固定相固定相固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化化化化学学学学键键键键合合合合固固固固定定定定相相相相：

9、将将将将各各各各种种种种不不不不同同同同基基基基团团团团通通通通过过过过化化化化学学学学反反反反应应应应键键键键合合合合到到到到硅硅硅硅胶胶胶胶（担担担担体）表面的游离羟基上。体）表面的游离羟基上。体）表面的游离羟基上。体）表面的游离羟基上。反相色谱反相色谱反相色谱反相色谱：固定相：固定相：固定相：固定相：C-18C-18柱柱柱柱 流动相：甲醇流动相：甲醇流动相：甲醇流动相：甲醇第10页，本讲稿共42页2 2、液液-固吸附色谱固吸附色谱 基本原理基本原理基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；：组分在固定相吸附

10、剂上的吸附与解吸；固定相固定相固定相固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 缺点缺点缺点缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾：非线性等温吸附常引起峰的拖尾：非线性等温吸附常引起峰的拖尾：非线性等温吸附常引起峰的拖尾；第11页，本讲稿共42页3 3、离子对色谱（分离有机酸、有机碱）离子对色谱（分离有机酸、有机碱）原原原原理理理理：将将将将一一一一种种种种（或或

11、或或多多多多种种种种）与与与与溶溶溶溶质质质质离离离离子子子子电电电电荷荷荷荷相相相相反反反反的的的的离离离离子子子子（对对对对离离离离子子子子或或或或反反反反离离离离子子子子）加加加加到到到到流流流流动动动动相相相相中中中中使使使使其其其其与与与与溶溶溶溶质质质质离离离离子子子子结结结结合合合合形形形形成成成成离离离离子子子子对对对对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。化合物，从而控制溶质离子的保留行为。化合物，从而控制溶质离子的保留行为。化合物，从而控制溶质离子的保留行为。阴阴阴阴离离离离子子子子分分分分离离离离：常常常常采采采采用用用用烷烷烷烷基基基基铵铵铵铵类类类类，如如如如氢氢氢氢氧

12、氧氧氧化化化化四四四四丁丁丁丁基基基基铵铵铵铵或或或或氢氢氢氢氧氧氧氧化十六烷基三甲铵作为对离子；化十六烷基三甲铵作为对离子；化十六烷基三甲铵作为对离子；化十六烷基三甲铵作为对离子；阳阳阳阳离离离离子子子子分分分分离离离离：常常常常采采采采用用用用烷烷烷烷基基基基磺磺磺磺酸酸酸酸类类类类，如如如如己己己己烷烷烷烷磺磺磺磺酸酸酸酸钠钠钠钠作作作作为为为为对对对对离离离离子；子；子；子；反相离子对色谱反相离子对色谱反相离子对色谱反相离子对色谱：固定相：非极性的疏水键和相固定相：非极性的疏水键和相固定相：非极性的疏水键和相固定相：非极性的疏水键和相(C-18C-18柱柱柱柱)流动相：含有对离子的甲醇

13、流动相：含有对离子的甲醇流动相：含有对离子的甲醇流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈水或乙腈水或乙腈水或乙腈-水水水水第12页，本讲稿共42页4 4、离子交换色谱离子交换色谱 固定相固定相固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；基基基基本本本本原原原原理理理理：组组组组分分分分在在在在固固固固定定定定相相相相上上上上发发发发生生生生的的的的离离离离子子子子交交交交换换换换反反反反应应应应；不不不不同同同同组组组组分分分分与与与与离离离离子子子子交换剂之间亲和

14、力的大小不同。交换剂之间亲和力的大小不同。交换剂之间亲和力的大小不同。交换剂之间亲和力的大小不同。应用应用应用应用：可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：可离解的化合物，氨基酸、核酸等。：可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第13页，本讲稿共42页5 5、空间、空间排阻色谱排阻色谱 固定相：固定相：固定相：固定相：凝胶凝胶凝胶凝胶(具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布具有一定大小孔隙分布)；原原原原理理理理：按按按按分分分分子子子子大大大大小小小小分分分分离离离离。小小小小分分分分子子子子可可可可以以以以进进进进入入入入到到到到凝凝凝凝胶胶胶胶

15、空空空空隙隙隙隙，由由由由其其其其中中中中通通通通过过过过，出出出出峰峰峰峰最最最最慢慢慢慢；中中中中等等等等分分分分子子子子只只只只能能能能通通通通过过过过部部部部分分分分凝凝凝凝胶胶胶胶空空空空隙隙隙隙，中中中中速速速速通通通通过过过过；而而而而大大大大分分分分子子子子被被被被排排排排斥斥斥斥在在在在外外外外，出出出出峰峰峰峰最最最最快快快快；溶溶溶溶剂剂剂剂分分分分子子子子小小小小，故故故故在在在在最后出峰。最后出峰。最后出峰。最后出峰。全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；全部在死体积前出峰；可可可可对对对对相相相相对对对对分分分分子子子子质质质质量量量量在在在在

16、100-10100-105 5范范范范围围围围内的化合物按质量分离内的化合物按质量分离内的化合物按质量分离内的化合物按质量分离 第14页，本讲稿共42页3-4 3-4 液相色谱固定相液相色谱固定相 1.1.1.1.液液液液-液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相液分配及离子对分离固定相 （1 1）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体）全多孔型担体 由由由由氧氧氧氧化化化化硅硅硅硅、氧氧氧氧化化化化铝铝铝铝、硅硅硅硅藻藻藻藻土土土土等等等等制制制制成成成成的的的的多多多多孔孔孔孔球球球球体体体体；早早早早期期期期采采采采用用用用100100mm的的的的大颗粒

17、，表面涂渍固定液，性能不佳。大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳。现采用现采用现采用现采用1010mm以下的小颗粒以下的小颗粒以下的小颗粒以下的小颗粒 （2 2）表面多孔型担体）表面多孔型担体）表面多孔型担体）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）（薄壳型微珠担体）30304040mm的的的的玻玻玻玻璃璃璃璃微微微微球球球球，表表表表面面面面附附附附着着着着一一一一层层层层厚厚厚厚度度度度为为为为1 1 22mm的的的的多多多多孔孔孔孔硅硅硅硅胶胶胶胶。表表表表面面面面积积积积小小小小，柱柱柱柱容容

18、容容量量量量低低低低；需需需需要要要要高高高高灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度的的的的检测器。检测器。检测器。检测器。现在现在现在现在510 510 mm全多孔型担体使用广泛全多孔型担体使用广泛全多孔型担体使用广泛全多孔型担体使用广泛第15页，本讲稿共42页化学键合固定相化学键合固定相 定定定定义义义义：用用用用化化化化学学学学反反反反应应应应的的的的方方方方法法法法通通通通过过过过化化化化学学学学键键键键把把把把有有有有机机机机物物物物分分分分子子子子 结合到担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相结合到担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相结合到担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相结合

19、到担体表面。（目前应用最广、性能最佳的固定相）制备方法：制备方法：制备方法：制备方法：a.a.硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：硅氧碳键型：SiSiOOC C b.b.硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：硅碳键型：SiSiC C c.c.硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：硅氮键型：SiSiN N d.d.硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：硅氧硅碳键型：SiSiOOSi Si C C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；第16页，本讲稿共42页化学键合固定相的特点化学键合固定相的

20、特点（1 1）表面无液坑，比一般液体固定相）表面无液坑，比一般液体固定相）表面无液坑，比一般液体固定相）表面无液坑，比一般液体固定相传质快传质快传质快传质快；（2 2）无固定液流失，增加了色谱柱）无固定液流失，增加了色谱柱）无固定液流失，增加了色谱柱）无固定液流失，增加了色谱柱稳定性和稳定性和稳定性和稳定性和寿命寿命寿命寿命（3 3）可键合不同官能团，）可键合不同官能团，）可键合不同官能团，）可键合不同官能团，选择性好选择性好选择性好选择性好（4 4）有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；有利于梯度洗脱；第17页，本讲稿共42页 2.2.液液-固吸附色谱固定相固吸附色谱固定相 种类：

21、硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；结构类型：全多孔型和薄壳型；目前，目前，目前，目前，5 510 10 mm硅胶硅胶硅胶硅胶微粒（全多孔型）使用最广微粒（全多孔型）使用最广微粒（全多孔型）使用最广微粒（全多孔型）使用最广 第18页，本讲稿共42页3.3.离子交换色谱分离固定相离子交换色谱分离固定相 结构类别：结构类别：结构类别：结构类别：（1 1）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换树脂）薄壳型离子交换

22、树脂）薄壳型离子交换树脂 薄薄壳壳玻玻璃璃珠珠为为担担体体，表表面面涂约涂约1%1%的离子交换树脂；的离子交换树脂；（2 2）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 键键合合薄薄壳壳型型；键键合合微微粒粒担担体体型（键合离子交换基团）型（键合离子交换基团）树脂类别：树脂类别：树脂类别：树脂类别：（1 1）阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强酸酸酸酸性性性性、弱酸性）弱酸性）弱酸性）弱酸性）（2 2）阴阴阴阴离离离离子子子子交交交交换换换换树树树树脂脂脂脂（强强强强碱碱碱碱性性性性、弱弱弱弱碱性）碱性）碱性）碱性）第19页，本

23、讲稿共42页 4.4.空间排阻分离固定相空间排阻分离固定相（1 1）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。水为流动相。适用于常压排阻分离。（2 2）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶）半硬质凝胶 苯乙烯苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3 3）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；多孔硅胶、多孔玻珠等；化化学学稳稳定定性性、

24、热热稳稳定定性性好好、机机械械强强度度大大，流流动动相相性性质质影影响响小小，可在较高流速下使用。可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。第20页，本讲稿共42页3-5 3-5 液相色谱的流动相液相色谱的流动相 1.1.流动相特性流动相特性 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流流流流动动动动相相相相对对对对组组组组分分分分有有有有亲亲亲亲和和和和力力力力，流流流流动动动动相相相相组组组组成成成成改改改改

25、变变变变，极极极极性性性性改改改改变变变变，可可可可显显显显著著著著改改改改变组分分离状况变组分分离状况变组分分离状况变组分分离状况 第21页，本讲稿共42页2.2.选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1 1）尽量使用）尽量使用）尽量使用）尽量使用高纯度高纯度高纯度高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。坏色谱柱和使检测器噪声增加。坏色谱柱和使检测器噪声增加。坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2 2）避免流动相与固定相发生作用避免流动相与固

26、定相发生作用避免流动相与固定相发生作用避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。而使柱效下降或损坏柱子。而使柱效下降或损坏柱子。而使柱效下降或损坏柱子。（3 3）试样在流动相中应有适宜的）试样在流动相中应有适宜的）试样在流动相中应有适宜的）试样在流动相中应有适宜的溶解度溶解度溶解度溶解度，防止产生沉淀并在柱，防止产生沉淀并在柱，防止产生沉淀并在柱，防止产生沉淀并在柱中沉积。中沉积。中沉积。中沉积。（4 4）溶剂粘度小些）溶剂粘度小些）溶剂粘度小些）溶剂粘度小些 （5 5）流动相同时还应满足）流动相同时还应满足）流动相同时还应满足）流动相同时还应满足检测器检测器检测器检测器的要求。当使用

27、紫外检测器时，的要求。当使用紫外检测器时，的要求。当使用紫外检测器时，的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收流动相不应有紫外吸收流动相不应有紫外吸收流动相不应有紫外吸收。第22页，本讲稿共42页3.3.流动相选择流动相选择 在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。在选择流动相时，溶剂的极性是选择的重要依据。例：采用正相液例：采用正相液例：采用正相液例：采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时液分配分离时：首先选择中等极性溶

28、剂，若组分的保留时液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。间太短，降低溶剂极性，反之增加。间太短，降低溶剂极性，反之增加。间太短，降低溶剂极性，反之增加。常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序：水水水水(最大最大最大最大)甲酰胺甲酰胺甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈乙腈乙腈 甲醇甲醇甲醇甲醇 乙醇乙醇乙醇乙醇 丙醇丙醇丙醇丙醇 丙酮丙酮丙酮丙酮 二二二二氧六环氧六环氧六环氧六环 四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚乙醚乙醚 异丙醚异

29、丙醚异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷 氯氯氯氯仿仿仿仿 溴乙烷溴乙烷溴乙烷溴乙烷 苯苯苯苯 四氯化碳四氯化碳四氯化碳四氯化碳 二硫化碳二硫化碳二硫化碳二硫化碳 环己烷环己烷环己烷环己烷 己烷己烷己烷己烷 煤油煤油煤油煤油(最小最小最小最小)采采采采用用用用二二二二元元元元或或或或多多多多元元元元组组组组合合合合溶溶溶溶剂剂剂剂作作作作为为为为流流流流动动动动相相相相可可可可以以以以灵灵灵灵活活活活调调调调节节节节流流流流动动动动相相相相的的的的极极极极性性性性或或或或增增增增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。加选择性，以改进分离或调整出峰时间。加选择性，以改进分离或调整出峰时间

30、。加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第23页，本讲稿共42页3-63-6 高效高效液相色谱仪器液相色谱仪器 high performance liquid chromatographhigh performance liquid chromatograph第24页，本讲稿共42页液相色谱仪（液相色谱仪（1 1）第25页，本讲稿共42页液相色谱仪（液相色谱仪（2 2）第26页，本讲稿共42页流程及主要部件流程及主要部件 process and main assembly of process and main assembly of HPLCHPLC1.1.流程流程第27页，本讲稿共42页2.

31、2.主要部件主要部件(1)(1)高压泵高压泵高压泵高压泵 为为为为了了了了获获获获得得得得高高高高柱柱柱柱效效效效，HPLCHPLC使使使使用用用用粒粒粒粒度度度度很很很很小小小小的的的的固固固固定定定定相相相相（1010mm），液液液液体体体体流流流流经经经经色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱受受受受到的阻力大到的阻力大到的阻力大到的阻力大 应具有流量稳定、压力平稳无脉动等特性。应具有流量稳定、压力平稳无脉动等特性。应具有流量稳定、压力平稳无脉动等特性。应具有流量稳定、压力平稳无脉动等特性。分为恒流泵、恒压泵，各有优缺点。目前恒流泵逐渐取代恒压泵。分为恒流泵、恒压泵，各有优缺点。目前恒流泵逐渐取代恒压

32、泵。分为恒流泵、恒压泵，各有优缺点。目前恒流泵逐渐取代恒压泵。分为恒流泵、恒压泵，各有优缺点。目前恒流泵逐渐取代恒压泵。第28页，本讲稿共42页(2)(2)梯度洗提装置（梯度洗提装置（P84P84）梯度洗提：梯度洗提：梯度洗提：梯度洗提：流动相中含有两种或以上不同极性的溶剂，流动相中含有两种或以上不同极性的溶剂，流动相中含有两种或以上不同极性的溶剂，流动相中含有两种或以上不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相的组成来改善和提在分离过程中按一定程序连续改变流动相的组成来改善和提在分离过程中按一定程序连续改变流动相的组成来改善和提在分离过程中按一定程序连续改变流动相的组成来改善和提高

33、分离效果。高分离效果。高分离效果。高分离效果。与气相色谱中程序升温的区别：与气相色谱中程序升温的区别：与气相色谱中程序升温的区别：与气相色谱中程序升温的区别：（GCGC）程序升温通过改变）程序升温通过改变）程序升温通过改变）程序升温通过改变柱温柱温柱温柱温来达到改善分离来达到改善分离来达到改善分离来达到改善分离（HPLCHPLC）梯度洗提通过改变）梯度洗提通过改变）梯度洗提通过改变）梯度洗提通过改变流动相的组成流动相的组成流动相的组成流动相的组成来改善分离来改善分离来改善分离来改善分离第29页，本讲稿共42页(3)(3)进样装置进样装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用

34、通常使用六通阀六通阀，第30页，本讲稿共42页(4)(4)色谱柱色谱柱 柱体为直型不锈钢管，标准柱子的内径为柱体为直型不锈钢管，标准柱子的内径为柱体为直型不锈钢管，标准柱子的内径为柱体为直型不锈钢管，标准柱子的内径为4.6 mm 4.6 mm 或或或或 3.9mm3.9mm，柱长柱长柱长柱长151530 cm30 cm，填料一般，填料一般，填料一般，填料一般510510 mm。发展趋势是减小。发展趋势是减小。发展趋势是减小。发展趋势是减小填料粒度填料粒度填料粒度填料粒度以以以以提高柱效和提高柱效和提高柱效和提高柱效和减小柱径减小柱径减小柱径减小柱径第31页，本讲稿共42页(5)(5)检测器检测

35、器 a.a.紫外检测器紫外检测器紫外检测器紫外检测器 应用最广，适用对紫外有吸收的物质，应用最广，适用对紫外有吸收的物质，应用最广，适用对紫外有吸收的物质，应用最广，适用对紫外有吸收的物质，特点：特点：特点：特点：通用性较好，对大部分有机化合物有响应；通用性较好，对大部分有机化合物有响应；通用性较好，对大部分有机化合物有响应；通用性较好，对大部分有机化合物有响应；灵敏度较高；灵敏度较高；灵敏度较高；灵敏度较高；检测器对流动相的温度变化和流速不敏感（梯度洗提）；检测器对流动相的温度变化和流速不敏感（梯度洗提）；检测器对流动相的温度变化和流速不敏感（梯度洗提）；检测器对流动相的温度变化和流速不敏感

36、（梯度洗提）；第32页，本讲稿共42页光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（PADPAD、DADDAD）紫紫紫紫外外外外检检检检测测测测器器器器的的的的重重重重要要要要进进进进展展展展；采采采采用用用用20482048个个个个二二二二极极极极管管管管或或或或更更更更多多多多组组组组成成成成阵阵阵阵列列列列，得到得到得到得到三维色谱三维色谱三维色谱三维色谱-光谱图。光谱图。光谱图。光谱图。优点优点优点优点:(1)(1)可获得组分的全部光谱信息，很快定性鉴定组分；可获得组分的全部光谱信息，很快定性鉴定组分；可获得组分的全部光谱信息，很快定性鉴定组分；可获得组分的全部光谱信息，很快定性鉴定组分

37、；(2)(2)可判断组分纯度。可判断组分纯度。可判断组分纯度。可判断组分纯度。第33页，本讲稿共42页b.b.荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）高灵敏度、高选择性；高灵敏度、高选择性；利用试样具有荧光特利用试样具有荧光特性性 对多环芳烃，维生素对多环芳烃，维生素B B、黄曲霉素、卟啉类化合黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响酸、甾类化合物等有响应；应；第34页，本讲稿共42页 c.c.示差折光检测器（通用型检测器）示差折光检测器（通用型检测器）（differential refractive index detecto

38、r）可可可可连连连连续续续续检检检检测测测测参参参参比比比比池池池池和和和和样样样样品品品品池池池池中中中中溶溶溶溶液液液液之之之之间间间间的的的的折折折折光光光光指指指指数数数数差差差差值值值值，差值与浓度呈正比。差值与浓度呈正比。差值与浓度呈正比。差值与浓度呈正比。通通通通用用用用型型型型检检检检测测测测器器器器（每每每每种种种种物物物物质质质质具具具具有有有有不不不不同同同同的的的的折折折折光光光光指指指指数）；数）；数）；数）；缺缺缺缺点点点点：对对对对温温温温度度度度敏敏敏敏感感感感、不能用于梯度洗脱；不能用于梯度洗脱；不能用于梯度洗脱；不能用于梯度洗脱；第35页，本讲稿共42页3-

39、7 3-7 分离类型选择分离类型选择 choice of separation typeschoice of separation types第36页，本讲稿共42页3-8 3-8 HPLCHPLC的的应用应用 application of HPLCapplication of HPLC 1.1.1.1.环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶固定相：薄壳型硅胶(37(37 5050 m)m)流动相：正己烷流动相：正己烷 流流 速：速：1.5 1.5 mL/minmL/min 色谱柱：色谱柱：5050cmcm

40、2.5mm(2.5mm(内径内径)检测器：示差折光检测器检测器：示差折光检测器 可对水果、蔬菜中的农药可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。残留量进行分析。第37页，本讲稿共42页2.2.稠环芳烃的分析稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质。稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：流动相：20%20%甲醇甲醇-水水 100%100%甲醇甲醇 线性梯度淋洗，线性梯度淋洗，2%/2%/minmin 流流 速：速：1 1mL/minmL/min 柱柱 温：温：5050 C C 柱柱 压：压：70 70 10104 4 PaPa 检测器：紫外检测器检测器：

41、紫外检测器第38页，本讲稿共42页3-9 3-9 液相制备色谱液相制备色谱 制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效方制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效方制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效方制备色谱：利用色谱技术分离、制备大量纯组分的有效方法。法。法。法。分析HPLC制备HPLC目的目的样品组成信息纯品回收通常研究大部分或全部样品组分通常只对一种或几种样品组分感兴趣第39页，本讲稿共42页1.1.色谱柱的柱容量（柱负荷）色谱柱的柱容量（柱负荷）分析柱：分析柱：不影响柱效时的最大进样量；制备柱：制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；超载：超载：进样量超过柱容

42、量。柱效迅速下降，峰变宽。制备柱允许超载制备柱允许超载（以柱效下降一半或容量因子（以柱效下降一半或容量因子k k降低降低10%10%为宜）为宜）第40页，本讲稿共42页2.2.液相制备色谱的方法液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：收集组分时，通常有以下情况：（1 1）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率使用制备柱，超载提高效率使用制备柱，超载提高效率使用制备柱，超载提高效率(图图图图3-3-2828）；）；）；）；（2 2）两主成分之间的小组分；）两主成

43、分之间的小组分；）两主成分之间的小组分；）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主超载，分离切分使待分离组分成为主超载，分离切分使待分离组分成为主超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。成分（富集）后，再次分离制备。成分（富集）后，再次分离制备。成分（富集）后，再次分离制备。第41页，本讲稿共42页3.3.液相制备色谱仪液相制备色谱仪 液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪液相制备色谱仪 ：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；检测器后增加馏分收集器。大、采用制备柱；检测器后增加馏分收集器。制备柱制备柱制备柱制备柱：内径：内径20205050mmmm，柱长，柱长5050cmcm。第42页，本讲稿共42页