植物细胞转基因技术.pptx

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1、 间接转化法：农杆菌介导法 病毒介导法植物基因转化技术方法 DNA直接转化法：基因枪法 电击法 花粉管通道法 化学物质诱导法 显微注射法 脂质体法第1页/共39页 间接转化法是以生物体为媒介的植物转基因方法,有农杆菌介导法和病毒介导法。间接转化法间接转化法第2页/共39页 农杆菌介导法是以农杆菌为媒介对植物进行遗传转化的方法。1.农杆菌介导法农杆菌介导法第3页/共39页 它是通过根癌农杆菌的TiTi质粒(T Tumer umer i inducing nducing plasmid)plasmid)和 发 根 农 杆 菌 的 RiRi质 粒(R Root oot i inducing nduc

2、ing plasmid)plasmid)上的一段T-DNAT-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。第4页/共39页 T-DNA T-DNA能够进行高频率的转移,而且TiTi质粒和RiRi质粒上可以插入到50kb50kb的外源基因,因此TiTi质粒和RiRi质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。第5页/共39页 T-DNAT-DNA可以将其携带的外源基因整合到植物基因组中，T T-DNA-DNA 上较重要的是 T T 区两端左右边界各为 2525bp bp 的重复序列。其中1414bp bp 是中心,分1010bp bp 和4

3、 4bp bp 两组,是完全保守的。这两个边界是T T-DNA-DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重要。T-DNA第6页/共39页vir基因 Ti 质粒的质粒的 vir 区大小为区大小为30kb,分分 VirA、B、C、D、E、G、H 等等7 个操纵子个操纵子,一共有一共有24 个个基因共同控制着基因共同控制着 T-DNA 的的加工和转移加工和转移,它们总它们总称调控子。称调控子。第7页/共39页叶盘叶盘消毒消毒切取切取土壤农杆土壤农杆菌浸泡菌浸泡筛选培养基筛选培养基愈伤组织愈伤组织分化幼苗分化幼苗第8页/共39页优点优点：技术较技术较成熟成熟,转化转化效率高效率高操作简单，不需要特殊仪

4、器，培养操作简单，不需要特殊仪器，培养周期短周期短外源基因多以外源基因多以单拷贝单拷贝或低拷贝插入受体细胞或低拷贝插入受体细胞,稳稳 定性好，减少了共抑制等基因沉默现象。定性好，减少了共抑制等基因沉默现象。可将较可将较大片段大片段DNA完整地转移到植物基因组中完整地转移到植物基因组中 等。等。第9页/共39页 缺点：主要转化双子叶植物。T-DNA可以在植物染色体的任何区域内插入,有可能导致有益基因的插入失活。迄今所获得的近 200种转基因植物中80%以上是通过根癌农杆菌系统转化获得的。第10页/共39页病毒介导法是以病毒为媒介对植物进行遗传转化 的载体系统。具体来说就是将外源基因插入到病 毒基

5、因组中,通过病毒对植物细胞的感染而将外源 基因导入植物细胞的一种植物转基因方法。2.病毒介导法病毒介导法第11页/共39页利用植物病毒介导法对植物基因进行遗传转化效 率比较高,但它的安全性受到质疑,主要用于动物 的基因转移。第12页/共39页 直接转化法(又称DNA直接导入法),它指不依赖于生物体将裸露的DNA直接转移到植物细胞和原生质体中,导致细胞转化的技术,与间接转化法相比,直接转化法不需构建载体,因此又叫无载体介导转化法。它适用于对农杆菌侵染不敏感的植物,使用此法的前提是需要建立良好的细胞或原生质体培养及再生系统。DNA直接转移法第13页/共39页 DNA直接导入法最大的优点是无需选择宿

6、主,可以导入生物细胞；缺点是嵌合基因整合进宿主染色体的频率低。该方法可以分为化学物质诱导法、电穿孔法、脂质体法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法和花粉管通道法。第14页/共39页基因枪法电击法花粉管通道法化学物质诱导法显微注射法脂质体法第15页/共39页 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，最后整合到植物基因组并得以表达从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。1.基因枪法基因枪法第16页/共39页DNA1.2 m钨弹钨弹头头吸附吸附特制手枪特制手枪射击植物射击植物装入装入

7、第17页/共39页第18页/共39页优点：克服了受体材料的限制，不必制备原生质体。实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。缺点：进去的DNADNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，拷贝数多，不易获得再生植株。第19页/共39页 至今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法以外应用最广泛的基因转移技术。此法已在葡萄、水稻等植物转基因中应用,并获得转基因植株。基因枪法也可以有效地用于叶绿体的转化，还可以转移RNA、DNA克隆等。第20页/共39页 是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体的质膜上形成瞬时可逆性开放小孔,为外源DNA提供通道,借

8、此导入DNA等遗传物质,达到转化的目的。由于质膜具有可修复性,外加电压造成的膜穿孔可在一定的时间内自动修复,从而使细胞恢复到正常的生理状况。2.电击法电击法第21页/共39页植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入电击混合入电击缓冲液缓冲液1-2kV,3-25 F电击电击愈伤组织愈伤组织幼苗幼苗分化分化第22页/共39页优点：操作简便，可以一次转化许多原生质体，转化效 率较高，特别适于瞬间表达。缺点：有原生质体培养的麻烦,电穿孔易造成原生质体损伤使再生率降低。该法已在甘蔗、大麦小孢子、剪股颖等植物的基因转化当中。第23页/共39页花粉管通道法是利用花粉管通道

9、法是利用植物授粉后植物授粉后,所形成的所形成的天然花粉管通道天然花粉管通道,经珠经珠心通道心通道,将外源将外源DNADNA携携带入胚囊带入胚囊,从而达到转从而达到转化目的的一种植物转化目的的一种植物转基因方法。基因方法。3.花粉管通道法花粉管通道法第24页/共39页优点：适用范围广，不依赖组织培养人工再生植株；可直接获得转基因种子，育种时间短，在鉴定 时可直接针对目的性状的表现型来进行,简单快 捷；转化速度较快，变异性状稳定较快；方法简单,不需要复杂昂贵的仪器设备。第25页/共39页缺点：转化受体受植物花期的限制，同时必须充分了解 每一种植物的开花受精的时间过程。在自然田间进行操作，受环境条件

10、的影响很大。操作的经验性很强,需要一定的技巧。利用此方法获得水稻、烟草、甘蓝、小麦等植物的转基因植株。第26页/共39页化学物质诱导法是以原生质体为受体,借助于特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。常用的转化细胞的化学物质有PEG(聚乙二醇)、PLO(多聚鸟氨酸)、PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG法应用较多,效果较好。PEG法是一种通过化学物质PEG处理去壁的原生质体作为转化受体,改变细胞膜的通透性使原生质体获得转化的方法。4.化学物质诱导法化学物质诱导法第27页/共39页优点：PEG法操作简单、成本低、结果较稳定、重复性 好、无需昂贵的基因转化仪器，且嵌合转化体很 少产生。第28页

11、/共39页缺点：原生质体培养再生难度较大；原生质体再生培养的转化植株变异率高,易产生白 化苗，且由于 PEG法对原生质体活力有害，转化 率低。应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡椒等植物的转基因植株。第29页/共39页显微注射法是使用毛细微管(一般针尖的直径为 0.5nm),在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞 或原生质体中的一种直接而完善的方法。5.显微注射显微注射DNA第30页/共39页该方法是Pena等1987年首创的,在用此方法进行 基因导入时,通常需要把原生质体或培养的细胞固 定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处理 使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固着的毛细管将原生质

12、体吸着在管口,再进行操作。第31页/共39页优点：转化率高，特别是在没有合适的DNA载体系统时 更有价值对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接 受位点受体不用特殊的选择系统可以控制转移的量和转移物的浓度 第32页/共39页缺点：设备和技术的要求较高要想获得转化的植株,需要注射大量的细胞或原生 质体，费时费工对细胞有损伤，一次处理细胞数量不能太多，比 较适合大细胞操作，主要用于动物的基因转化中第33页/共39页脂质体是根据生物膜的结构和功能特性，人工用 脂类化合物合成的双层膜囊。脂质体法是Dellaporta等在1981年创造的,就是将 包含外源基因的脂质体与植物原生质体融合,从而 达到转基

13、因目的一种转化方法。6.脂质体法脂质体法第34页/共39页优点：可避免DNA在导入受体细胞之前被核酸酶降解；适用的植物种类广泛重复性高,包装在脂质体内的 DNA或RNA可稳定地贮藏。第35页/共39页缺点：在包装DNA时必须有短时间的超声处理,会使相当 多的DNA断裂；所用材料必使用具有全能性的原生质体作为受体 细胞；转化效率较低。主要用于动物的基因转化,在植物上此方法介导的基因转移在烟草、青菜等植物上有报道。第36页/共39页几种植物转基因方法比较转基因方法转基因方法转化的优点转化的优点转化的缺点转化的缺点DNA间接转化法间接转化法农杆菌介导基因农杆菌介导基因转移转移受体种类，可以在原生质受

14、体种类，可以在原生质体、和细胞团、组织器官体、和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高；周期短，转化率高；转化转化双子叶植物双子叶植物为主。为主。大多数单子叶植物和裸大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。禾谷类作物中的应用。转化体常出现转化体常出现“嵌合嵌合”现象，需在严格条件下现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化加以选择以淘汰未转化细胞细胞DNA直接转化法直接转化法1.1.基因枪转化法基因枪转化法2.2.电击法电击法3.PEG3.PEG介导基因转介导基因转化法化法4.4.花粉管通道法花粉管通道法无宿主限制无宿主限制，适用于各种，适用于各种单、双子叶植物，操作简单、双子叶植物，操作简单单转化转化效率低效率低，需要，需要专门专门设备设备（电击仪、显微操（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数作仪或基因枪），多数需要需要原生质体原生质体与愈伤组与愈伤组织，周期太长（电击法）织，周期太长（电击法）第37页/共39页谢谢！第38页/共39页感谢您的观看！第39页/共39页