标准病理组织制片和染色技术2.ppt

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1、标准病理组织制片和染色技术2一、前一、前言言病理组织制片和染色技术是病理学的病理组织制片和染色技术是病理学的重要组成部分，病理的教学、科研、临床重要组成部分，病理的教学、科研、临床活检、尸解检验、诊断等都离不开制片染活检、尸解检验、诊断等都离不开制片染色技术工作。因此，组织的制片和染色技色技术工作。因此，组织的制片和染色技术是研究病理学的重要的方法和手段之一。术是研究病理学的重要的方法和手段之一。各种组织制片成切片标各种组织制片成切片标本，须要经过一个比较繁多本，须要经过一个比较繁多的过程，现将制作切片的主的过程，现将制作切片的主要程序和制片的种类，介绍：要程序和制片的种类，介绍：组织取材、固

2、定、脱水、透明、组织取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、粘片、烤片、脱浸蜡、包埋、切片、粘片、烤片、脱蜡、各级酒精、水洗、常规染色、脱蜡、各级酒精、水洗、常规染色、脱水、透明、树胶封固。水、透明、树胶封固。石蜡制片程序石蜡制片程序冰冻制片程序冰冻制片程序组织取材、冰冻切片、干燥组织取材、冰冻切片、干燥粘片、固定、染色、脱水、透明、粘片、固定、染色、脱水、透明、树胶封片。树胶封片。非切片非切片（了解内容）（了解内容）1整整体体封封藏藏法法低低等等动动物物自自身身薄薄片片如如：鱼鱼鳞片、蛙胚。鳞片、蛙胚。2涂涂片片法法如如：血血液液、精精液液、痰痰、胸胸腹腹水等水等3、磨磨片片法法主主要要用

3、用有有钙钙盐盐坚坚硬硬材材料料，牙牙齿、介壳、坚骨手工磨齿、介壳、坚骨手工磨4分分离离法法a、压压片片法法动动终终板板的的制制备备b、撕撕碎法碎法c压碎法压碎法二、取材（实验病理、临床病理、尸解诊断）二、取材（实验病理、临床病理、尸解诊断）1、实验病理取材、实验病理取材(1)动物的杀死：动物杀死方法很动物的杀死：动物杀死方法很多，根据动物大小、种别、观多，根据动物大小、种别、观察目的而定。察目的而定。A：断头法：青蛙、小鼠等较小的动物：断头法：青蛙、小鼠等较小的动物B：空气栓塞法：兔猫（：空气栓塞法：兔猫（2040ml）狗狗100mlC：麻醉法：乙醚、氯仿、：麻醉法：乙醚、氯仿、4%巴比妥巴比

4、妥作作V注射注射1ml/1kg，20%氨基甲酸氨基甲酸乙酯（尿烷）作腹腔注射乙酯（尿烷）作腹腔注射5ml/1kgD：击头法：大鼠：击头法：大鼠 E：放血法：眼球放血（小鼠）：放血法：眼球放血（小鼠）股动脉放血，大动物：牛、猪股动脉放血，大动物：牛、猪原则原则：要尽避免使动物长时间：要尽避免使动物长时间陷入痛苦和濒于死亡状态，以免疫陷入痛苦和濒于死亡状态，以免疫组织成份，结构发生变化，引起病组织成份，结构发生变化，引起病理假象。理假象。(1)取取材材时时所所用用的的刀刀要要锐锐利利，动动作作仔仔细，细，不可来回切割，勿使组织受挤压。不可来回切割，勿使组织受挤压。(2)注意组织，器官的切面：注意组

5、织，器官的切面：肾脏肾脏纵切纵切脑脑（表表面面和和脑脑沟沟成成直直角角）垂垂直切直切肝脾肝脾横纵均可横纵均可 （3）保持组织清洁：血液，污物，保持组织清洁：血液，污物，粘液，食物用生理盐水洗净。粘液，食物用生理盐水洗净。（4）保持标本新鲜：动物死后立保持标本新鲜：动物死后立即固定。即固定。(5)切取组织大小：切取组织大小：0.50.50.2cm110.3cm1.51.50.5cm2.2.临床活检取材：临床活检取材：临床活检取材：临床活检取材：注意事项：注意事项：注意事项：注意事项：（1 1）申请单位姓名与标本一致，防止混乱差错。申请单位姓名与标本一致，防止混乱差错。申请单位姓名与标本一致，防止

6、混乱差错。申请单位姓名与标本一致，防止混乱差错。（2 2）检检检检查查查查标标标标本本本本是是是是否否否否符符符符合合合合要要要要求求求求干干干干涸涸涸涸坏坏坏坏变变变变，固固固固定定定定液液液液多少。多少。多少。多少。（3 3）取材时描写：大小，形态，色泽，硬度等。取材时描写：大小，形态，色泽，硬度等。取材时描写：大小，形态，色泽，硬度等。取材时描写：大小，形态，色泽，硬度等。（4 4）芝麻或针帽大小组织芝麻或针帽大小组织芝麻或针帽大小组织芝麻或针帽大小组织染伊红？：镜纸染伊红？：镜纸染伊红？：镜纸染伊红？：镜纸包好包好包好包好（5 5）常见肿瘤取材方法：略。常见肿瘤取材方法：略。常见肿瘤取

7、材方法：略。常见肿瘤取材方法：略。3.尸体解剖组织（脏器）取材：略。尸体解剖组织（脏器）取材：略。三固定（三固定（fixalion）固定：新鲜组织浸泡在适宜的化固定：新鲜组织浸泡在适宜的化学试剂内借助于化学试剂的作用，使学试剂内借助于化学试剂的作用，使组织或细胞内蛋白质凝聚，沉淀，成组织或细胞内蛋白质凝聚，沉淀，成为溶性并保持组织细胞原有的形态结为溶性并保持组织细胞原有的形态结构：称为固定。所使用的化学试剂配构：称为固定。所使用的化学试剂配成的溶液，称为固定液。成的溶液，称为固定液。1.固定的目的固定的目的(1)迅速防止组织细胞死后自溶和腐败迅速防止组织细胞死后自溶和腐败（组组织织失失氧氧释释

8、放放溶溶酶酶体体酶酶溶溶解解组组织织）(2)固定或沉淀细胞内或组织液中蛋白，脂固定或沉淀细胞内或组织液中蛋白，脂肪，糖原，无机盐和色素，使其不被溶肪，糖原，无机盐和色素，使其不被溶解和消失。解和消失。(3)使组织硬化，有一定弹性使组织硬化，有一定弹性抵抗以后的抵抗以后的脱水，透明，使组织发生扭曲，变形。脱水，透明，使组织发生扭曲，变形。(4)某些传染性标本，能防止疫病的扩散。某些传染性标本，能防止疫病的扩散。（如结核等）（如结核等）(5)保存细胞内固有的物质：如包含体，线保存细胞内固有的物质：如包含体，线粒体，溶酶体等。粒体，溶酶体等。(6)可增强染色作用可增强染色作用(7)有利于各种细胞折光

9、率。有利于各种细胞折光率。(8)固定后能产生良好的反差。固定后能产生良好的反差。2、固定的注意事项：、固定的注意事项：(1)必须及时固定：夏天必须及时固定：夏天4h冬天冬天24h就自溶。就自溶。(2)固定液的用量：标本体积固定液的用量：标本体积1015倍。倍。(3)固定时间：根据组织不同的种类、性质固定时间：根据组织不同的种类、性质大小、固定液的种类而定。大小、固定液的种类而定。(4)固定用的容器要足够大，一般标本缸，固定用的容器要足够大，一般标本缸，广口瓶广口瓶4 4、固定液的分类、配制和特性、固定液的分类、配制和特性、固定液的分类、配制和特性、固定液的分类、配制和特性（1 1）分类）分类）

10、分类）分类A A：凝固性酒类、丙酮、氯化汞等：凝固性酒类、丙酮、氯化汞等：凝固性酒类、丙酮、氯化汞等：凝固性酒类、丙酮、氯化汞等非凝固性甲醛、戌二醛等非凝固性甲醛、戌二醛等非凝固性甲醛、戌二醛等非凝固性甲醛、戌二醛等B B：醛类甲醛、戌二醛：醛类甲醛、戌二醛：醛类甲醛、戌二醛：醛类甲醛、戌二醛氧化剂类重铬酸钾、高猛酸钾氧化剂类重铬酸钾、高猛酸钾氧化剂类重铬酸钾、高猛酸钾氧化剂类重铬酸钾、高猛酸钾蛋白质变性酒精、苦味酸蛋白质变性酒精、苦味酸蛋白质变性酒精、苦味酸蛋白质变性酒精、苦味酸C C：单纯固定液：单纯固定液：单纯固定液：单纯固定液-10%-10%甲醛甲醛甲醛甲醛95%95%乙醇乙醇乙醇乙醇

11、混合固定液混合固定液混合固定液混合固定液-BoonsConroys-BoonsConroys(2)(2)常用固定液的配制及性质：常用固定液的配制及性质：常用固定液的配制及性质：常用固定液的配制及性质：A A：10%10%甲醛甲醛甲醛甲醛-应用广泛应用广泛应用广泛应用广泛(注：注：注：注：36-40%36-40%作为活检、作为活检、作为活检、作为活检、尸解、一般形态学观察常用尸解、一般形态学观察常用尸解、一般形态学观察常用尸解、一般形态学观察常用)优点：刺激性气味、对组织渗透力强、固定均优点：刺激性气味、对组织渗透力强、固定均优点：刺激性气味、对组织渗透力强、固定均优点：刺激性气味、对组织渗透力

12、强、固定均匀、能保存脂类（神经、髓鞘、高尔基体、匀、能保存脂类（神经、髓鞘、高尔基体、匀、能保存脂类（神经、髓鞘、高尔基体、匀、能保存脂类（神经、髓鞘、高尔基体、线粒体、糖类保存）价格便宜、配制简单、线粒体、糖类保存）价格便宜、配制简单、线粒体、糖类保存）价格便宜、配制简单、线粒体、糖类保存）价格便宜、配制简单、使用方便。使用方便。使用方便。使用方便。缺点：固定久产生色素缺点：固定久产生色素缺点：固定久产生色素缺点：固定久产生色素 图附图附图附图附 10%10%中性甲醛中性甲醛中性甲醛中性甲醛(ph7.3-7.6)(ph7.3-7.6)浓甲醛浓甲醛浓甲醛浓甲醛100ml100ml自来水自来水自

13、来水自来水900ml900ml加碳酸钙至饱和加碳酸钙至饱和加碳酸钙至饱和加碳酸钙至饱和ph7.3-7.6ph7.3-7.6(组织化学、免疫组化、保存抗原组织化学、免疫组化、保存抗原组织化学、免疫组化、保存抗原组织化学、免疫组化、保存抗原)10%10%中性缓冲甲醛中性缓冲甲醛中性缓冲甲醛中性缓冲甲醛(ph7.0)(ph7.0)浓甲醛浓甲醛浓甲醛浓甲醛100ml100ml蒸馏水蒸馏水蒸馏水蒸馏水900ml900mlNaHNaH2 2popo4 4HH2 2o4go4gNaNa2 2HpoHpo4 46.56.5B：酒精酒精优点：固定又脱水：保存糖原，尿酸盐。优点：固定又脱水：保存糖原，尿酸盐。（脱

14、落细胞、培养细胞也常用）（脱落细胞、培养细胞也常用）缺点：渗透力强缺点：渗透力强-组织表层固缩组织表层固缩C：丙酮：用于酸的固定：丙酮：用于酸的固定(磷酸酶、磷酸酶、胰酶、氧化酸胰酶、氧化酸)收缩剧烈，挥发、易燃、与水、收缩剧烈，挥发、易燃、与水、醇、氯仿、醚混合醇、氯仿、醚混合混合固定液混合固定液混合固定液混合固定液FAAFAA：浓甲醛：浓甲醛：浓甲醛：浓甲醛100ml100ml95%95%酒精酒精酒精酒精850ml850ml冰醛醋冰醛醋冰醛醋冰醛醋58ml58ml(收缩小、核染色质固定好收缩小、核染色质固定好收缩小、核染色质固定好收缩小、核染色质固定好)BoulnsBoulns液：苦味酸饱

15、和液液：苦味酸饱和液液：苦味酸饱和液液：苦味酸饱和液75ml75ml浓甲醛浓甲醛浓甲醛浓甲醛75ml75ml冰醋酸冰醋酸冰醋酸冰醋酸5ml5ml(对组织收缩小，固定均匀、保存细微结构、软化皮肤、对组织收缩小，固定均匀、保存细微结构、软化皮肤、对组织收缩小，固定均匀、保存细微结构、软化皮肤、对组织收缩小，固定均匀、保存细微结构、软化皮肤、肌健、结缔组织较好肌健、结缔组织较好肌健、结缔组织较好肌健、结缔组织较好)3 3、固定的原理、固定的原理、固定的原理、固定的原理甲醛为例，甲醛与组织蛋白反应是多样而复杂的。PCONH+HCH+P-CONHOP-CON-C-P-CONHH亚甲基桥肽键 甲醛蛋白质分

16、子之进行交换，形成亚甲基桥，把蛋白质分子串联起来，使蛋白变性，破坏了蛋白质的立体结构，达到固定目的。四、洗涤四、洗涤 组织在固定后，一定要把渗透组织在固定后，一定要把渗透到里面的固定液到里面的固定液(沉淀物或结晶沉淀物或结晶)洗洗去，然后再进行下一步程序，洗涤去，然后再进行下一步程序，洗涤必须彻底，否则留在组织中的固定必须彻底，否则留在组织中的固定液有可能妨碍染色。液有可能妨碍染色。洗涤的原则：洗涤的原则：1、固定液为乙醇或酒精混合液一般不要、固定液为乙醇或酒精混合液一般不要冲洗。冲洗。2、固定液为水配制者，用水流水冲洗、固定液为水配制者，用水流水冲洗3、凡含有铬酸、重铬酸钾的固定液、凡含有铬

17、酸、重铬酸钾的固定液-洗涤洗涤4、含有苦味酸用乙醇配制的固定液、含有苦味酸用乙醇配制的固定液-洗涤洗涤5、含有氯化汞固定液、含有氯化汞固定液-冲洗冲洗-碘液去碘液去汞汞(zenkers)-5%硫化硫酸钠去碘硫化硫酸钠去碘6、洗涤时间大动物组织、洗涤时间大动物组织8h以上、以上、小动物组织小动物组织2-8h洗涤方法：流水冲洗洗涤方法：流水冲洗 五、脱五、脱水水脱脱水水就就是是利利用用某某些些化化学学试试剂剂与与水水混混合合内内的的水水份份彻底脱除。彻底脱除。要求：要求：1、脱水剂能与水任何比例混合、脱水剂能与水任何比例混合2、脱水剂也能与透明剂混合、脱水剂也能与透明剂混合3、脱水要彻底否则无法进

18、行透明、脱水要彻底否则无法进行透明4、低浓度、低浓度-高浓度循序进行高浓度循序进行(酒精是依酒精是依次递增、水是级差递减次递增、水是级差递减)常用的各级酒精梯度，常用的各级酒精梯度，达到脱水目的【达到脱水目的【60%70%80%90%100%I100%】乙醇结构式乙醇结构式CH3CH3OH水的结构式水的结构式H2OH-OH-OH-OH-OH-HRHR乙醇的羟基（乙醇的羟基（OH）和水形成氢键，）和水形成氢键，水分子与乙醇分子逐步缔合在一起。水分子与乙醇分子逐步缔合在一起。乙醇与水相混容的原理：乙醇与水相混容的原理：常用的脱水剂常用的脱水剂1、酒精：特点：能力强，使组织硬化，和二甲苯酒精：特点：

19、能力强，使组织硬化，和二甲苯互溶。互溶。缺点：使组织收缩，变脆。缺点：使组织收缩，变脆。2、丙酮：比酒精脱水强，收缩厉害。临床病理用丙酮：比酒精脱水强，收缩厉害。临床病理用于快速脱水于快速脱水3、二氧陆环：有毒性，既脱水又透明使组织收缩二氧陆环：有毒性，既脱水又透明使组织收缩小不硬化小不硬化4、正丁醇：有毒性，既脱水又透明皮肤、骨正丁醇：有毒性，既脱水又透明皮肤、骨叔丁叔丁醇发松子醇醇发松子醇5、脱水时间：脱水时间：根据组织大小、类别、种属、分别安排根据组织大小、类别、种属、分别安排六、透明六、透明(clearing)组织经脱水后，不能直接浸入石蜡组织经脱水后，不能直接浸入石蜡中，还要一个媒剂

20、透明过程。透明剂既中，还要一个媒剂透明过程。透明剂既可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，可与脱水剂相混合又能和石蜡相混合，起到桥梁作用，当组织中全部被透明剂起到桥梁作用，当组织中全部被透明剂点有时，光线可以透过呈现透明状态点有时，光线可以透过呈现透明状态-称组织透明。称组织透明。常用的透明剂常用的透明剂1、二甲苯：易挥发、易燃、透明力强、收缩、变二甲苯：易挥发、易燃、透明力强、收缩、变脆脆(能与无水乙醇相混合，又能与石蜡相混合，作两能与无水乙醇相混合，又能与石蜡相混合，作两组透明。组透明。)2、氯仿：比二甲苯透明力强，不收缩、变脆。时氯仿：比二甲苯透明力强，不收缩、变脆。时间长间长24h，收缩小

21、，收缩小3、苯：甲苯和二甲苯相同。易挥发、易燃、有毒苯：甲苯和二甲苯相同。易挥发、易燃、有毒性性香柏油香柏油5.苯甲酸甲酯苯甲酸甲酯-收缩小、时间收缩小、时间1224h，常用为火棉胶切片常用为火棉胶切片6.俄甘油俄甘油7.苯酚苯酚透明时间：眼观组织呈透明状态透明时间：眼观组织呈透明状态小组织小组织10min中组织中组织20-40min大组织大组织1-2h(如果组织不透明如果组织不透明1、脱、脱水未尽水未尽2、组织太厚、组织太厚3、时间不够、时间不够)七、浸蜡（七、浸蜡（Infilftrition）组织经过媒剂的透明作用后，组织经过媒剂的透明作用后，移入熔化的石蜡内浸渍称为浸蜡。移入熔化的石蜡内

22、浸渍称为浸蜡。、石蜡：石蜡：切片蜡切片蜡_软蜡软蜡50以下，酶，保存抗原活性以下，酶，保存抗原活性(纯度高密度好纯度高密度好)硬蜡硬蜡50以上以上-6264工业石蜡工业石蜡_质地较差，价格便宜质地较差，价格便宜纯度低，熔点不准确纯度低，熔点不准确2、根据组织的不同选用：、根据组织的不同选用：6062-皮肤、骨组织、硬纤维瘤皮肤、骨组织、硬纤维瘤58以下以下-作免疫组化酶作免疫组化酶 3、恒温箱温度一般高于石蜡熔点、恒温箱温度一般高于石蜡熔点454、浸蜡可分三级、浸蜡可分三级软蜡软蜡54-56硬蜡硬蜡58-60硬蜡硬蜡60625、脱水、透明、浸蜡时间表、脱水、透明、浸蜡时间表小动物组织（鼠）脱水

23、、透明和浸蜡时间表小动物组织（鼠）脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配程序项目时间分配175%乙醇时间长短均可乙醇时间长短均可285%乙醇乙醇25h395%乙醇乙醇25h495%乙醇乙醇25h5无水乙醇无水乙醇20min6无水乙醇无水乙醇30min7无水乙醇无水乙醇30min8二甲苯二甲苯15min9二甲苯二甲苯30min10二甲苯二甲苯30min11石蜡石蜡565830min12石蜡石蜡565830min13石蜡石蜡606212h5、脱水、透明、浸蜡时间表、脱水、透明、浸蜡时间表外检组织脱水、透明和浸蜡时间表外检组织脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配程序项目时间分配185%乙醇时间长短

24、均可乙醇时间长短均可295%乙醇乙醇12h395%乙醇乙醇12h495%乙醇乙醇12h5无水乙醇无水乙醇12h6无水乙醇无水乙醇12h7无水乙醇无水乙醇12h8二甲苯二甲苯1h9二甲苯二甲苯12h10二甲苯二甲苯12h11石蜡石蜡565812h12石蜡石蜡565812h13石蜡石蜡606224h5、脱水、透明、浸蜡时间表尸体解剖组织脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配175%乙醇时间长短均可285%乙醇 510h395%乙醇 510h495%乙醇 510h5无水乙醇25h6 无水乙醇25h7无水乙醇 25h8二甲苯30min左右9二甲苯12h10 二甲苯 12h11石蜡5658 12h12石

25、蜡5658 12h13 石蜡6062 24h5、脱水、透明、浸蜡时间表、脱水、透明、浸蜡时间表大动物组织脱水、透明和浸蜡时间表大动物组织脱水、透明和浸蜡时间表程序项目时间分配程序项目时间分配175%乙醇时间长短均可乙醇时间长短均可285%乙醇乙醇25h395%乙醇乙醇25h495%乙醇乙醇25h5无水乙醇无水乙醇30min6无水乙醇无水乙醇30min7无水乙醇无水乙醇12h8二甲苯二甲苯30min9二甲苯二甲苯30min10二甲苯二甲苯1h左右左右11石蜡石蜡565830min12石蜡石蜡565812h13石蜡石蜡606223h八、包埋（八、包埋（Emledding）组织经过固定、脱水、透明、

26、后再用石组织经过固定、脱水、透明、后再用石蜡铸成蜡块称包埋。蜡铸成蜡块称包埋。1.埋石蜡的要求：埋石蜡的要求：(1)尽可能和浸尽可能和浸蜡熔点一致蜡熔点一致(2)南方：南方：5862北方：北方：52582.方法：方法：3.(1)最大平面向下压平最大平面向下压平(2)管状管状束壁束壁皮肤皮肤竖埋竖埋(3)包埋石蜡温度高于石蜡熔包埋石蜡温度高于石蜡熔点点57(4)石蜡凝固后打开蜡框修整石蜡凝固后打开蜡框修整蜡块蜡块(5)贴好标签贴好标签九、石蜡切片法九、石蜡切片法 1.切片前的准备工作：切片前的准备工作：(1)切片机切片机A：轮转切片机：轮转切片机B：平推式切片机：平推式切片机(2)刀片刀片(刀刀

27、)一次性刀片或切片刀一次性刀片或切片刀(磨刀磨刀)(3)清洁的载玻片清洁的载玻片(4)甘蛋白油、白胶、毛笔、钙子甘蛋白油、白胶、毛笔、钙子 2.切片制作过程切片制作过程(实习实习)注意事项：注意事项：a)切片厚度：切片厚度：5um(镜下镜下46um)b)刀片要锋利否则会出现卷片、起皱、不连刀片要锋利否则会出现卷片、起皱、不连结、破碎不完整。结、破碎不完整。c)刀与组织的角度刀与组织的角度46d)各个部件，螺丝应旋紧否则震动切片厚薄各个部件，螺丝应旋紧否则震动切片厚薄不均。不均。一、染色的目的一、染色的目的病病理理学学的的各各种种切切片片，都都必必须须应应用用一一种种以以上上的的染染料料通通过过

28、不不同同的的方方法法将将切切片片的的各各种种不不同同的的组组织织结结构构给给予予显显示示出出来来，以以利利于于镜镜下下辨辨别别其各种不同的形态，做出正确的诊断。其各种不同的形态，做出正确的诊断。十、染色十、染色二、染色的作用二、染色的作用 1、化学作用：、化学作用：染染液液中中的的阴阴阳阳离离子子与与组组织织中中的的阴阴阳阳离离子子相相互互作作用用所所完完成成的的染染色色。染染液液中中有有酸酸性性和和碱碱性性染染料料之之分分，酸酸性性染染料料有有染染色色作作用用的的部部分分是是阴阴离离子子，而而碱碱性性染染料料有有染染色色作作用用的的部部分分则则是是阳阳离离子子。组组织织的的各各种种细细胞胞中

29、中细细胞胞核核为为酸酸性性，它它可可与与苏苏木木素素液液中中的的阳阳离离子子发发生生反反应应。细细胞胞桨桨中中的的阳阳离离子子则则与与伊伊红红液液中中的阴离子发生反应，完成染色。的阴离子发生反应，完成染色。2 2、物理作用：、物理作用：染染料料通通过过浸浸透透，分分散散浸浸入入到到组组织织的的间间隙隙中中，因因受受分分子子的的引引力力作作用用，染染液液中中的的色色素粒子被吸附而完成染色过程。素粒子被吸附而完成染色过程。3 3、染色方法、染色方法应应用用于于常常规规病病理理切切片片的的染染色色方方法法称称为为普普通通染染色色法法或或HEHE染染色色法法，而而用用特特别别的的染染色色法则称为特殊染

30、色法。法则称为特殊染色法。1、二甲苯、二甲苯510min2、二甲苯、二甲苯510min3、无水酒精、无水酒精30 se1min4、无水酒精、无水酒精30 se1min5、95%酒精酒精30 se1min6、95%酒精酒精30 se1min7、90%酒精酒精30 se1min8、80%酒精酒精30 se1min9、Harris苏木素苏木素10se15min10、自来水洗、自来水洗30sec1min11、1%盐酸酒精盐酸酒精30sec12、流水冲洗、流水冲洗1015min或温水洗或温水洗510min13、1%伊红染色伊红染色25min14、80%乙醇洗去多余的染色乙醇洗去多余的染色1min15、9

31、0%酒精酒精301min16、95%酒精酒精301min17、95%酒精酒精301min18、100%酒精酒精301min19、100%酒精酒精301min20、石碳酸二甲苯、石碳酸二甲苯1min21、二甲苯、二甲苯1min22、二甲苯、二甲苯1min23、二甲苯、二甲苯1min24、中性树胶封固、中性树胶封固HEHE染色法程序染色法程序结果：细胞核：蓝色，软骨基质钙盐等深结果：细胞核：蓝色，软骨基质钙盐等深蓝色；细胞浆深浅不同的粉红色，蓝色；细胞浆深浅不同的粉红色，嗜酸性颗粒鲜红色；胶原纤维呈粉嗜酸性颗粒鲜红色；胶原纤维呈粉红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维红色，肌纤维呈鲜红色，弹力纤维呈亮红色

32、，红血球为桔红色，蛋白呈亮红色，红血球为桔红色，蛋白基质为粉红色。基质为粉红色。染色时的注意事项染色时的注意事项（1 1）切切片片烘烘烤烤以以切切片片附附贴贴牢牢固固为为原原则则，否否则容易掉片。则容易掉片。（2 2）切切片片脱脱蜡蜡一一定定要要彻彻底底，不不然然会会导导致致染染色深浅不一。色深浅不一。（3 3）切切片片染染苏苏木木素素前前可可令令其其无无水水化化，这这样样可可延延长长苏苏木木素素的的寿寿命命。因因为为每每次次染染色色前前，切切片片水水洗洗，然然后后进进入入染染液液虽虽然然每每次次带带入入的的水水分分很很少少，但但随随着着次次数数的的增增加加，所所带带入入的的水水分分足足可可以

33、以稀稀释释染染液液影影响染色的质量。响染色的质量。（4 4）切切片片在在苏苏木木素素的的染染色色时时间间应应充充分分宁宁过过勿勿不不足足。对对于于初初学学者者来来说说更更应应过过染染，否则分化会过度导致染色过浅。否则分化会过度导致染色过浅。（5 5）切切片片分分化化时时，要要根根椐椐不不同同的的组组织织来来确确定分化时间，并不断积累经验。定分化时间，并不断积累经验。（6 6）伊伊红红染染色色时时间间也也要要充充分分，经经低低浓浓度度洒洒精精时时应应仔仔细细观观察察，必必要要时时快快速速通通过过，以免过于褪色。以免过于褪色。（7 7）切切片片致致无无水水酒酒精精后后，不不要要在在控控干干无无水水

34、酒酒精精时时让让切切片片干干涸涸，可可以以不不经经控控干干直直接接地地进进入入碳碳酸酸二二甲甲苯苯（也也可可以以进进入入二二甲甲苯苯酒酒精精混混合合1 1：1 1）碳碳酸酸有有较较强强的的吸吸水性透明也好很适合南方地区。水性透明也好很适合南方地区。（8 8）切切片片从从二二甲甲苯苯中中取取出出封封固固时时，切切不不能能让让其其干干涸涸，因因南南方方地地区区空空气气潮潮湿湿干干涸涸的的切切片片与与空空气气接接触触，可可吸吸收收其其水水份份。这这样样的的切切片片很很容容易易裉裉色色。切切片片不不干干涸涸，表表面面被被着着二二甲甲苯苯，由由于于它它不不溶溶于于水水起起到与水隔绝的作用。到与水隔绝的作

35、用。（9 9）滴滴中中性性树树胶胶封封盖盖切切片片，胶胶不不能能太太浓浓，太太浓浓胶胶难难以以均均匀匀铺铺开开，且且易易产产生生气气泡泡，又又不不能能太太稀稀过过稀稀的的胶胶由由于于二二甲甲苯苯含含量量较较多多，当当切切片片干干燥燥时时，二二甲甲苯苯挥挥发发掉掉，胶胶封封的的切切片片收收缩缩，即即可可导导致致一一半半切切片片没没有有被被胶胶封封固固的的结结果果。最合适的胶应是滴下成珠。最合适的胶应是滴下成珠。（1010）封封固固切切片片时时，盛盛胶胶的的瓶瓶子子及及瓶瓶盖盖四四周周不不要要留留有有余余胶胶，否否则则瓶瓶盖盖难难以以打打开开。因因此此每每次次用用完完后后都都必必须须将将其其擦擦干

36、干净净。当当打打不不开开瓶瓶盖盖时时应应放放入入烤烤箱箱中烘烤，即可打开。中烘烤，即可打开。（1111）标标签签附附贴贴要要认认真真，不不要要贴贴得得歪歪歪歪斜斜斜，影响切片的外观斜，影响切片的外观.染液的配制染液的配制(一）苏木素的配制一）苏木素的配制1 1、苏木素的种类：、苏木素的种类：A A、明明 矾矾 苏苏 木木 素素（Harris,Mayer,Harris,Mayer,EhrlichEhrlich）B B、铁苏木素（、铁苏木素（Wiegert,HeidnhainWiegert,Heidnhain）C C、钨苏木素（、钨苏木素（PTAHPTAH）D D、铅苏木素（、铅苏木素（Soeci

37、aSoecia）（1 1）HarrisHarris苏木素的配制（苏木素的配制（Harris.l900Harris.l900）苏木素苏木素 0.5g 0.5g无水乙醇无水乙醇 5ml 5ml钾明矾（硫酸铝钾）钾明矾（硫酸铝钾）10g 10g蒸馏水蒸馏水 100ml 100ml氧化汞氧化汞 0.25g 0.25g冰醋酸冰醋酸 4ml 4ml预先把苏木素溶于无水酒精中配制时，取预先把苏木素溶于无水酒精中配制时，取预先把苏木素溶于无水酒精中配制时，取预先把苏木素溶于无水酒精中配制时，取一三角瓶倒入蒸镏水，再加入钾明矾，于电炉上一三角瓶倒入蒸镏水，再加入钾明矾，于电炉上一三角瓶倒入蒸镏水，再加入钾明矾，

38、于电炉上一三角瓶倒入蒸镏水，再加入钾明矾，于电炉上加热至加热至加热至加热至90909090左右时，拔去电源加入酒精苏木素，左右时，拔去电源加入酒精苏木素，左右时，拔去电源加入酒精苏木素，左右时，拔去电源加入酒精苏木素，再插上电源继续加热，持续再插上电源继续加热，持续再插上电源继续加热，持续再插上电源继续加热，持续35353535分钟，拔去电源，分钟，拔去电源，分钟，拔去电源，分钟，拔去电源，加入氧化汞，此时可产生大量的气泡，应防止其加入氧化汞，此时可产生大量的气泡，应防止其加入氧化汞，此时可产生大量的气泡，应防止其加入氧化汞，此时可产生大量的气泡，应防止其溢出瓶外。再继续通电加热，煮沸后持续溢

39、出瓶外。再继续通电加热，煮沸后持续溢出瓶外。再继续通电加热，煮沸后持续溢出瓶外。再继续通电加热，煮沸后持续35353535分分分分钟，此时溶液表面看呈深紫黑色，即可撤离电源，钟，此时溶液表面看呈深紫黑色，即可撤离电源，钟，此时溶液表面看呈深紫黑色，即可撤离电源，钟，此时溶液表面看呈深紫黑色，即可撤离电源，用备好的冰凉水，将烧瓶迅速的插入水中，让染用备好的冰凉水，将烧瓶迅速的插入水中，让染用备好的冰凉水，将烧瓶迅速的插入水中，让染用备好的冰凉水，将烧瓶迅速的插入水中，让染液迅速冷却，中止氧化放入暗处。于第二天过滤液迅速冷却，中止氧化放入暗处。于第二天过滤液迅速冷却，中止氧化放入暗处。于第二天过滤

40、液迅速冷却，中止氧化放入暗处。于第二天过滤后再加入冰醋酸，即可使用，染色时间后再加入冰醋酸，即可使用，染色时间后再加入冰醋酸，即可使用，染色时间后再加入冰醋酸，即可使用，染色时间5 5 5 515151515分分分分钟。钟。钟。钟。（2 2）MayerMayer氏苏木素（氏苏木素（Mayer,1903Mayer,1903）苏木素苏木素 0.1g 0.1g蒸镏水蒸镏水 100ml 100ml钾明矾钾明矾 5g 5g柠檬酸柠檬酸 0.1g 0.1g水合醛水合醛 5g 5g碘酸钠碘酸钠 20mg 20mg将蒸包馏水稍为加温，加入苏木素不将蒸包馏水稍为加温，加入苏木素不停地搅拌直至溶解，再加入钾明矾，

41、令其停地搅拌直至溶解，再加入钾明矾，令其溶解后再加入碘酸钠过滤后即可使用，染溶解后再加入碘酸钠过滤后即可使用，染色时间色时间10102020分钟，如果先用天表蓝为媒分钟，如果先用天表蓝为媒染剂，染色时可在染剂，染色时可在2 23 3分钟。分钟。配制苏木素的注意事项配制苏木素的注意事项1 1、苏苏木木素素可可以以配配成成5%5%或或10%10%，让让其其氧氧化化产产生生苏苏木木红红，然然后后根根椐椐每每次次配配制制溶溶液液的的量量，再决定加入多少。再决定加入多少。2 2、在在配配制制苏苏木木素素时时，三三角角烧烧瓶瓶的的选选择择也也很很重重要要，例例如如，配配制制500ml 500ml 的的溶溶

42、液液，应应选选用用 15001500 2000ml2000ml的的 三三 角角 烧烧 瓶瓶，配配 制制1000ml1000ml则则可可选选3000ml3000ml的的烧烧瓶瓶，这这样样溶溶液液在加入氧化汞时，才不会喷出瓶外。在加入氧化汞时，才不会喷出瓶外。3 3、冰冰醋醋酸酸一一定定要要在在溶溶液液过过滤滤后后加加入入如如果果过过滤滤前前加加入入，则则在在过过滤滤时时溶溶液液很很难难通通过过滤滤纸纸，这这主主要要是是冰冰醋醋酸草可造成对滤纸的损害。酸草可造成对滤纸的损害。(二）伊红的配制二）伊红的配制1 1、1%1%伊红洒精的配制伊红洒精的配制 伊红（水溶）伊红（水溶）5g 5g 70%-75

43、%70%-75%酒精酒精 500ml 500ml 取取少少许许蒸蒸馏馏水水来来溶溶解解伊伊红红或或称称曙曙红红，当当完完全全溶溶解解后后，再再加加入入酒酒精精，然然后后再再加加入入少许冰醋酸，此时溶液即可变为鲜红色。少许冰醋酸，此时溶液即可变为鲜红色。注注意意：冰冰醋醋酸酸一一定定要要加加进进去去如如果果没没有有加加入入冰醋酸，细胞浆将难以染得鲜艳。冰醋酸，细胞浆将难以染得鲜艳。2.2.切切片片染染完完苏苏木木素素后后的的分分化化，应应该该如如何何控控制和注意什么问题？制和注意什么问题？（1 1）分分化化液液中中盐盐酸酸不不能能高高于于1%1%，否否则则会会因因分分化化过过强强而而将将已已着着

44、色色的的颜颜色色大大部部分分脱脱水，造成染色过浅。水，造成染色过浅。（2 2）对对各各种种组组织织应应视视情情况况而而定定，如如淋淋巴巴结结的切片，应分化较长时间等。的切片，应分化较长时间等。（3 3）分分化化完完后后，应应在在显显微微镜镜下下观观察察，如如发发现现核核中中的的物物质质不不清清楚楚，则则应应继继续续分分化化至清晰为止。至清晰为止。（4 4）要认真操作，细心观察，不断总结。）要认真操作，细心观察，不断总结。胃类癌（瘤细胞小而一致）胃类癌（瘤细胞小而一致）瘤细胞的多形性瘤细胞的多形性病理性核分裂像病理性核分裂像平滑肌、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤平滑肌、平滑肌瘤和平滑肌肉瘤大肠腺体、腺瘤和

45、腺癌大肠腺体、腺瘤和腺癌正常鳞状上皮、乳头状瘤和鳞状细胞癌正常鳞状上皮、乳头状瘤和鳞状细胞癌淋巴管转移癌淋巴管转移癌肺淋巴管转移癌肺淋巴管转移癌冰冻切片冰冻切片冰冻切片冰冻切片一、种类：一、种类：1 1、低温恒冷箱切片法、低温恒冷箱切片法2 2、二氧化碳冰冻切片法、二氧化碳冰冻切片法3 3、甲醇循环制冷冰冻切片法、甲醇循环制冷冰冻切片法4 4、半导体冰冻切片法、半导体冰冻切片法5 5、氯乙烷冰冻切片法、氯乙烷冰冻切片法二、冰冻切片的目的二、冰冻切片的目的1 1、在在手手术术进进行行中中。突突然然发发现现病病人人的的病病变变与与原原诊诊断断不不相相符符合合或或者者怀怀疑疑时时需需要要病病理理给给

46、予确定。予确定。2 2、了了解解淋淋巴巴结结内内是是否否有有转转移移的的肿肿瘤瘤细细胞胞或或者者转转移移的的程程度度，以以利利于于确确定定以以后后的的治治疗疗措施。措施。3 3、对对于于已已确确定定恶恶性性肿肿瘤瘤的的病病人人则则需需要要了了解解其其手手术术范范围围是是否否足足够够，上上下下切切缘缘是是否否有有残残存的肿瘤细胞。存的肿瘤细胞。4 4、在剖腹探查所发现的肿块。、在剖腹探查所发现的肿块。5 5、显示组织中的脂肪类物质。、显示组织中的脂肪类物质。6 6、某些酶的显示如、某些酶的显示如ATPATP酶琥珀酸脱氢酶等。酶琥珀酸脱氢酶等。7 7、神经病理学中的某些染色法。、神经病理学中的某些

47、染色法。8 8、对某些物质所进行的免疫荧光的研究。、对某些物质所进行的免疫荧光的研究。三、冰冻切片的操作三、冰冻切片的操作（1 1）本本室室现现有有Shandon-AS620EShandon-AS620E型型冷冷冻冻切切片片机机的的主主要要性性能能。左左边边的的切切片片台台可可达达到到-60-60左左右右，冷冷冻冻箱箱内内在在0 0-30-30间间可可任任意意调调节节，箱箱面面上上有有电电子子控控制制板板，装装有有急急速速冷冷冻冻，即即放放上上标标本本启启动动该该键键机机器器马马上上进进行行冷冷冻冻工工作作并并持持续续1010分分钟钟；有有冷冷冻冻台台温温度度显显示示冷冷冻冻箱箱内内温温度度显

48、显示示；有即时除霜内温度显示；有即时除霜内温度显示；有有即即时时除除霜霜键键，启启动动该该键键机机器器可可持持续续工工作作1515分分钟钟，将将工工作作间间顶顶部部后后面面的的制制冷冷栅栅上上的的霜霜除除掉掉；有有照照明明键键，启启动动该该键键可可照照明明工工作作间间；有有消消毒毒键键当当进进行行一一星星期期的的工工作作后后，启启动动该该键键可可对对工工作作间间进进行行消消毒毒；有有工工作作间间面面的的密密锁锁键键启启动动键键可可将将工工作作间间锁锁住住，除除此此之之外外该该机机的的左左边边有有四四个个按按键键两两个个为为快快速速自自动动进进退退、两两个个为为微微小小进进退退、另另有有一一个个

49、手手动动旋旋钮，调节修块时的进退。钮，调节修块时的进退。（2 2）切切片片取取末末经经固固定定的的组组织织不不能能太太大大太太厚厚，厚厚者者冰冰冻冻费费时时，大大者者难难以以切切完完整整。最最好好2424 4mm2424 4mm。（3 3）取取出出组组织织支支承承器器，放放平平摆摆好好组组织织周周边边滴滴上上包包埋埋剂剂，速速放放入入冷冷冻冻台台上上冰冰冻冻，小小组组织织应应先先取取一一组组织织支支承承器器滴滴上上包包埋埋剂剂让让其其冻冻成成一一个小台再放上细小组织，滴上包埋剂。个小台再放上细小组织，滴上包埋剂。（4 4）将将冷冷冻冻好好的的组组织织块块夹夹紧紧于于切切片片机机上上修修平平切切

50、面。面。（5 5）调调好好厚厚度度，根根椐椐不不同同的的组组织织而而定定，一一般般在在5-10um.5-10um.（6 6）调调好好防防卷卷板板，制制作作冰冰冻冻切切片片的的调调节节，关关建建在在于于防防卷卷板板的的调调节节，这这就就要要求求要要细细心心，准准确确，将将其其调调校校，调调校校至至适适当当的的位位置置，此此时时切切片片。冰冰冻冻切切片片在在第第一一时时间间顺顺利利地地在在刀刀与与防防卷卷板板之之间间通通过过，平平整整地地躺躺在在持持刀刀器器的的铁铁板板上上。这这时时便便可可掀掀起起防防卷卷板板，取取一一载载片片，将其附贴上即可。将其附贴上即可。（7 7 7 7）用用用用于于于于附