核酸B学习教程.pptx

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1、2、RNAase牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease)RNase I 或 RNase A 最适pH：7.0-8.2 产物：3-嘧啶核苷酸或3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶RNase T1 耐热、耐酸 产物：3-鸟苷酸或3-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高第1页/共44页内切核酸酶对内切核酸酶对RNA的水解位点示意图的水解位点示意图5ppppOHPyPuPyPy1pppGACUpppGA3RNAaseIRNAaseIRNAaseT1RNAaseT1Pu：嘌呤：嘌呤Py：嘧啶：嘧啶第2页/共44页3、DNase牛胰脱氧核糖核酸酶，牛胰脱氧核糖核酸酶，DNas

2、e I 无碱基专一性，切断双链或单链DNA 产物：以5-磷酸为末端的寡核苷酸，最适 pH 78牛脾脱氧核糖核酸酶，牛脾脱氧核糖核酸酶，DNase 无碱基专一性,产物：以3-磷酸为末端的寡核苷酸,最适 pH 45DNA限制性内切酶限制性内切酶第3页/共44页外切核酸酶对核酸的水解位点外切核酸酶对核酸的水解位点5ppppOHBpppp3BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶（55端外切端外切5 5得得3 3）蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶（33端外切端外切3 3得得5 5）4 非专一性核酸酶类非专一性核酸酶类可作用于可作用于RNA 或或 DNA第4页/共44页二 核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收1天

3、然天然DNA2变性变性DNA3核苷酸总吸收值核苷酸总吸收值2202402602800.10.20.30.4波长（波长（nmnm）光光吸吸收收123DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱最大吸收峰为最大吸收峰为260 nm第5页/共44页三三 核酸的变性、复性及杂交核酸的变性、复性及杂交 （一）变性（一）变性DNADNA的变性过程的变性过程部分双螺旋解开部分双螺旋解开 无规则线团无规则线团 链内碱基配对链内碱基配对在物理、化学因素影响下，在物理、化学因素影响下，DNA碱基对间的氢键断裂，双碱基对间的氢键断裂，双螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有螺旋解开，这是一个是跃变过程，伴有A260增加（增加（增

4、色效增色效应应）,DNA的功能丧失。的功能丧失。第6页/共44页变性因素：热变性酸碱变性（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）变性后的理化性质：260nm吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。第7页/共44页增色效应与减色效应增色效应与减色效应增色效应增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大减色效应减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小。DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。第8页/共44页1 Tm1 Tm：熔解温度（熔解温度（melting temperaturemelting temperature）Polyd(A

5、-T)DNAPolyd(G-C)DNA的的变变性性发发生生在在一一个个很很窄窄的的温温度度范范围围内内，通通常常把把热热变变性性过过程程中中A260达达到到最最大大值值一一半半时时的的温温度度称称为为该该DNA的的熔熔解解温温度度，用用Tm表表示。示。某些某些DNADNA的的TmTm值值60801001.01.41.2100%A260t0CTmTmTmTmTmTm123123第9页/共44页 熔解温度熔解温度（Tm）浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260=1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。DNA的Tm一般在82

6、95之间第10页/共44页2、影响影响DNA的的Tm值的因素值的因素DNA均一性。均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。第11页/共44页G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44第12页/共44页介质中离子强度介质中离子强度离子强度高，Tm高。第13页/共44页（二）复性复性在一定条件下，变性在一定条件下，变性DNA 单链间碱基重新配对恢复单链间碱基重新配对恢复双螺旋结构，伴有双螺旋结构，伴有A260减小（减小（减色效应减色效应）,DNA的功的功能恢复。能恢复。第14页/共44页热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复

7、性。DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。复性速度可用Cot衡量。第15页/共44页Cot 是Co 与 t 的乘积，Co 为变性DNA（复性前）的原始浓度，以摩尔浓度（mol/L）表示，t为复性时间，以秒（s）表示。复性分数 f=1/1+kCot Cot 是指复性完成一半时的是指复性完成一半时的Cot值值。第16页/共44页不同DNA的复性动力学曲线。第17页/共44页（三）分子杂交分子杂交第18页/共44页分子杂交的原理示意图分子杂交的原理示意图不不 同同 来来 源源 的的DNA单单链链间间或或单单链链DNA与与RNA之之间间只只要要有有碱碱基基配配对对的的区区域域，在在复复性

8、性时时可可形形成成局局部部双双螺螺旋旋区区，称称核核酸酸 分分 子子 杂杂 交交（hybridization）制制备备特特定定的的探探针针（probe）通通过过杂杂交交技技术术可可进进行行基基因因的的检检测测和和定定位位研研究究。实实例例：southern印迹法印迹法第19页/共44页Southern印迹法印迹法限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割琼脂糖电泳琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记与放射性标记DNA探针杂交探针杂交放射自显影放射自显影用缓冲液用缓冲液转移转移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜带有带有DNA片片段的凝胶段的凝胶凝胶凝胶滤膜滤膜第20

9、页/共44页四 核酸的沉降特性与超速离心核酸的沉降特性与超速离心沉降系数（沉降系数（S）生生物物大大分分子子在在单单位位离离心心力力场场作作用用下下的的沉沉降降速速度度称称为为沉沉降降系系数数。即即沉沉降降系系数数是是微微颗颗粒粒在在离离心心力力场场的的作作用用下下，从从静静止止状状态态到到达达极极限限速速度度所所需需要要的的时时间间。其其单单位位用用SvedbergSvedberg，即，即s s表示，表示，s=110s=110-13-13秒。秒。沉降系数（沉降系数（S S）与分子量（）与分子量（M M）的关系）的关系M=RTsD(1-)Svederg方程方程:第21页/共44页不同构象的核酸

10、（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用Cs-Cl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。第22页/共44页第四节第四节 核酸的分离，合成，鉴定和序列测定核酸的分离，合成，鉴定和序列测定 一一 分离，纯化和定量分离，纯化和定量尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。第23页/共44页 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。D

11、NP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀 DNA分离纯化分离纯化第24页/共44页 紫外分光光度法紫外分光光度法(A260)定磷法（定磷法（DNA含磷含磷9.2%，RNA含磷含磷9.0%）定糖法（定糖法（DNA；二苯胺法，；二苯胺法，RNA；苔黑酚法）；苔黑酚法）（三）核酸的定量核酸的定量 第25页/共44页二 DNA的化学合成：的化学合成：合成方向：3 5端5-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。3-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护 第26页/共44页三三 一级结构的测定一级结构的测定（1）双脱氧终

12、止法双脱氧终止法英国 Sanger1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。第27页/共44页第28页/共44页第29页/共44页第30页/共44页MOV:MCB4.0DideoxysequencingofDNA第31页/共44页第32页/共44页（2）化学裂解法化学裂解法Maxam-Gilbert，1977原理：利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经侧序胶电泳和放射自显影得到侧序图谱。32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTA

13、CGT在G处：32p，32p-GCTAC在C处：32P-G和 32P-GCTA在T处：32P-GC和32P-GCTACG第33页/共44页第五节第五节 核酸的生物学功能和实践意义核酸的生物学功能和实践意义 一一 核酸与遗传信息的传递和表达核酸与遗传信息的传递和表达 （一）（一）DNADNA是基本遗传物质是基本遗传物质1944，O.Avery 肺炎双球菌转化实验1952，A.D Hershey 和M.Chase 噬菌体感染实验第34页/共44页遗遗 传传 密密 码码遗传密码遗传密码:DNADNA（或（或mRNAmRNA）中的核苷酸序列与蛋）中的核苷酸序列与蛋 白质中氨基酸序列之间的对应关系称白质

14、中氨基酸序列之间的对应关系称 为遗传密码。为遗传密码。密码子密码子(codon)：mRNAmRNA上每上每3 3个相邻的核苷酸编个相邻的核苷酸编 码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，码蛋白质多肽链中的一个氨基酸，这三个核苷酸就称为一个密码子或这三个核苷酸就称为一个密码子或 三联体密码三联体密码。第35页/共44页遗传密码字典遗传密码字典UACGUCAGUCAG第二位第二位第一位第一位（5）第三位第三位（3）UCAGUCAGUCAG第36页/共44页遗传密码的性质遗传密码的性质1、密码是无标点符号的且相邻密码子互不重叠。密码是无标点符号的且相邻密码子互不重叠。2、密码的简并性：由一种以上密码子编码同一

15、个密码的简并性：由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现氨基酸的现象称为简并性（象称为简并性（dogeneracy），对应于同一氨基酸的密码子称），对应于同一氨基酸的密码子称为同义密码子为同义密码子(Synonymouscodon)。密码的简并性可以减少有。密码的简并性可以减少有害突变害突变。3、密码的摆动性（变偶性）：密码的专一性主要是由第一第密码的摆动性（变偶性）：密码的专一性主要是由第一第二个碱基所决定，二个碱基所决定，tRNA上的反密码子与上的反密码子与mRNA密码子配对时，密码子配对时，密码子的第一、二位碱基是严格的，第三位碱基可以有一定的密码子的第一、二位碱基是严格的，第三位碱基可以有

16、一定的变动。变动。Crick称这一为称这一为变偶性变偶性（wobble）.4、密码的通用性和变异性密码的通用性和变异性5、64组密码子中，组密码子中，AUG既是的既是的Met密码，又是密码，又是起始密起始密码码；有；有三组密码不编码任何氨基酸，而是多肽链合成的终止密码子：三组密码不编码任何氨基酸，而是多肽链合成的终止密码子：UAG、UAA、UGA。第37页/共44页（二）RNA 功能1、参与蛋白质的合成 2、RNA的转录后加工与修饰3、参与基因表达的调控4、生物催化作用第38页/共44页 二二 核酸与病变核酸与病变 （一）（一）核酸与遗传疾病核酸与遗传疾病第39页/共44页（二）（二）核酸与病

17、毒核酸与病毒噬菌体噬菌体T2结构结构头部头部颈圈颈圈尾部尾部基板基板尾丝尾丝尖钉尖钉第40页/共44页动物病毒切面模式图动物病毒切面模式图被膜（脂蛋白、被膜（脂蛋白、碳水化合物）碳水化合物）衣壳（蛋白质）衣壳（蛋白质）突起（糖蛋白）突起（糖蛋白）病毒粒病毒粒（DNA或或RNA）核酸核酸第41页/共44页乙肝病毒乙肝病毒艾滋病毒艾滋病毒第42页/共44页三三人类基因组计划简介人类基因组计划简介（Human Genome Project，HGP）该计划是美国科学家在该计划是美国科学家在1985年率先提出，年率先提出，1990年正式启年正式启动。美、英、德、法、日先后参加了此项工作，动。美、英、德、

18、法、日先后参加了此项工作，1999年我国年我国成为成为HGP的第六个成员国。的第六个成员国。HGP旨在阐明人类基因组旨在阐明人类基因组DNA所具有的所具有的310109 9核苷酸的序核苷酸的序列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译列，发现所有的人类基因并阐明其在染色体上的位置，破译人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面地认识自我。认识自我。到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工到目前为止，已完成了人类基因组的框架图，测序的工作已基本完成。作已基本完成。HGP的实施，揭开了生命科学新的一页，它的实施，揭开了生命科学新的一页，它可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。可以造福于人类，但也面临的伦理的挑战。第43页/共44页感谢您的观看。感谢您的观看。第44页/共44页