解磷菌K_3的溶磷特性及其在不同土壤中定殖研究_虞伟斌1.docx

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1、 CHARACTERIZATION OF MINERAL PHOSPHATE-SOLUBILIZING BACTERIUM K3 AND COLONIZATION UNDER DIFFERENT SOIL By Yu Weibin A thesis Submitted to Nanjing Agricultural University For Master Degree Supervised by Prof. Xu Yangchun College of Resources and Environmental Sciences Nanjing Agricultural University

2、Nanjing 210095 P.R.China June 2010 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权南京农业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，

3、可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密 ，在 _ 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密 SC (请在以上方框内打 V ） 原 创 性 声 明 本论文研究内容 由 国家自然科学基金项目 高效解磷细菌在植物根际土壤中的行为特征研究 (编号： 30771258) 农业部重大国际合作研究项目 （ 948 项目） 固体有机废弃物高附加值资源化技术引进、创新研究与产业化开发 (编号： 2006-G62) 共同资助 特 此 致 谢 目录 目录 摘 3? . I ABSTRACT . Ill 第一章文献综述 . 1 1.0 lu s . 1 1.1 土壤中的磷 . 1 1.1.1

4、土壤中磷的形态和含量 . 1 1.1.2 土壤中磷的生物有效性 . 2 1.1.3 溶磷微生物在磷素循环中的作用 . 3 1.2 解磷微生物 . 4 1.2.1 解磷微生物的解磷机理 . 4 1.2.U 无机磷解磷机理 . 4 1.2.1.2 有机磷降解机理 . 5 1.2.2 解磷菌在土壤和植株根际分布 . 6 1.2.3 影响解磷菌溶磷效果的因素 . 7 1.3 研究的目的、意义及研究内容 . 8 1.3.1 研究的目的和意义 . 8 1.3.2 本研究的主要内容 . 9 1.4 技术路线 . 10 . 11 第二章解磷菌 K3解磷机理研究 . 17 2.0 弓唁 . 17 2.1 材料与

5、方法 . 17 2.1.1 供试菌株 . 17 2.1.2 培养基 . 17 2.1.3 种子液制备 . 17 2.1.4 菌株培养及测定 . 18 2.1.4.1 摇瓶培养 . 18 2.1.4.2 水溶性磷、 pH、 菌体生长量 . 18 2.1.4.3 菌液存机酸测定 . 18 2 丄 4.4 冇机酸对磷酸三钙溶解作用 . 18 解磷菌 K3 的溶磷特性及其在不同土壤中定殖研究 2.1.4.5 不同 pH 对培养基中磷酸钙溶解度影响 . 18 2.1.5 数据处理 . 19 2.2 结果与分析 . . . . . . . . 19 2.2.1 解磷菌 K3发酵液中有机酸种类和含量 . 1

6、9 2.2.2 解磷菌 K3 发酵液中水溶性磷、 pH、 菌体生长量和有机酸动态变化 . 19 2.2.3 有机酸种类和浓度对磷酸三钙溶解效果的影响 . 21 2.2.4 不同 pH 培养基中磷酸三钙的溶解度 . 21 2.3 Hit . 22 参考文献 . 23 第三章影响解磷菌 K3溶磷效果因素的研究 . 25 3.0 弓丨 W . 25 3.1 材料与方法 . 25 3.1.1 供试菌株 . 25 3 丄 2 培养基 . 25 3.1.3 不同碳源对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 25 3.1.4 不同氮源对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 26 3.1.5 不同 C/N 对解磷菌

7、 K3溶解磷酸三钙的影响 . 26 3.1.6 可溶性磷源对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 26 3.1.7 缓冲容量对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 26 3,1.8 重金属对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 26 3.1.9 数据处理 . 27 3.2 结果与分析 . 27 3.2.1 不同碳源对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 27 3.1.2 不同氮源对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 28 3.1.3 不同 C/N 对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 28 3.1.4 可溶性磷源对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 28 3.1.5 缓冲容量对解磷菌 K3溶解磷酸三钙

8、的影响 . 29 3.1.6 重金属对解磷菌 K3溶解磷酸三钙的影响 . 31 3_3 讨论 . 32 #想 . 33 第四章解磷菌 GFPKf 小麦根际定殖及对小麦生长的影响 . 35 4.0 弓丨 W. 35 4.1 材料与方法 . 35 4.U 供试土壤 . 35 4.1.2 试验设计 . 35 4 丄 3 测定项目与方法 . 36 4.1.3.1 小麦株高、有效穗数和产童测定 . 36 4.1.3.2“ 植株地上部干鲜重 . 36 4.1.3.3 土壤中解磷细菌的存活动态 . 36 4.1.3.4 小麦不同生育期土壤速效磷含量及植株磷素积累量 . 36 4.1.3.5 解磷菌株对土壤微

9、生物群落结构的影响 （ DGGE) . 36 4.2 结果与分析 . 37 4.2.1 施用解磷菌 GFPK3对小麦产量的影响 . 37 4.2.2 小麦株高、有效穗数及地上部干鲜重 . 37 4.2.3 小麦地上部和籽粒磷素积累量 . 38 4.2,4 解磷菌 0?卩 1两合土 淤土。淤土中解磷菌的数量从施入到第 42d 始终处于迅速下降过程， 42d 之后维持 在 104CFU/g 土达到平稳。而沙土和两合土中解磷菌数量在 1 至 28d 内始终保持在 105 CFU/g 土左右，之后降至104CFU/g 土维持平稳。与单施有机肥处理相比，有机肥加 解磷菌 K3 处理能够提高土壤中有效磷含

10、量，显著提高玉米干物重和磷素积累量。 5. 不同有机肥料对解磷菌 GFPK3 在土壤中的定殖研究发现，嚴基酸有机肥处理 的 GFPK3数量始终比其它四个处理多一个数量级，该处理从播种后第 7d 至 56d， 玉 米根际土中 GFPK3数量在 106 CFU/g 土至 105 CFU/g 土。根系扫描结果显示解磷菌 K3 增加了玉米的总根长和表面积，提高根系养分吸收，促进植物生长。 关键词：解磷细菌；溶磷特性；小麦；玉米；定殖 ABSTRACT CHARACTERIZATION OF PHOSPHATE-SOLUBILIZING BACTERIUM K3 AND COLONIZATION UND

11、ER DIFFERENT SOIL ABSTRACT Phosphate solubilizing microorganisms (PSMs) are ubiquitous in soil and could play an important role in phosphorous cycling, converting insoluble phosphate into soluble forms which are available to plants. Pseudomonas sp. K3 was previously identified with a high ability to

12、 solubilize tricalcium phosphate (TCP) and to promote the growth of maize seedlings. This study investigated the mechanism of phosphate solubilization and assessed the influence of different factors (e.g., carbon source, nitrogen forms, phosphate source and buffer capacity) on the phosphate solubili

13、zing ability of K3 in vitro. Furthermore, pot experiments were carried out to study the behavior of GFP-labelled strain K3 in different types of soils and rhizosphere. Different organic materials were also tested with K3 to screen the best organic carrier. The relationships among the number of GFPK3

14、, dynamic distributing in the rhizosphere, and phosphorus accumulation in plant were systemically investigated. The results were as follows: 1. After seven days of K3 growth in a liquid medium NBRIP, the P concentration in the solution increased from 6.54 pg/mL to 655.23 jag/mL， while the pH value d

15、ecreased from 7.0 to 3.99. Results from HPLC analysis showed that the solubilization of TCP was mainly caused by the release of 47.39 mmol/L malic acid, 25.67 mmol/L lactic acid and 1.89 mmol/L oxalic acid. At these concentrations, malic acid, lactic acid and oxalic acid could solubilize P about 535

16、.31 (ag/mL, 279.06 (ig/mL and 46.58 p,g/mL from TCP, respectively, suggesting that malic acid excretion by K3 was the main mechanism for P solubilization. 2. The effects of carbon and nitrogen forms and carbon to nitrogen ratios (C/N) on solubilization of TCP by K3 were assessed. The results showed

17、that carbon sources had strong influence on phosphate solubilization, and K3 had the highest capacity to dissolve TCP when glucose was added. Release of P reached maximum under glucose at 653.24 jig/mL and minimum under soluble starch at 4.83(ig/mL. Ammonium significant promoted P solubilization whe

18、n compared with nitrate and urea. The ability of K3 to dissolve TCP in 解磷菌 K3 的溶磷特性及 K 在不同土壤中定殖研究 went down to 32.13 pg/mL when ammonium and nitrate were added together. The P solubilization activity was strongly associated with C/N ratio, i.e.3 the lower C/N ratio, the higher activity of P solubili

19、zation. The highest dissolved P concentration was attained with the C/N ratio at 8:1. Results also showed that addition of soluble P in the medium could repress the ability of K3 to dissolve TCP. In addition, strain K3 was resistant to Zn, Pb and Cr， but sensitive to Cu. 3. Greenhouse experiment was

20、 conducted by using GFP labeled strain K3 (GFPK3). The results showed that the wheat yield, shoot height and dry weight were increased by 14.75%, 19.37% and 2.8% respectively, after supplied bio-organic fertilizer of GFPK3 when compared with the common organic manure treatment. The population of GFP

21、K3 was gradually decreasing in soil with the wheat growing. The total population of GFPK3 decreased from 107 CFU/g of soil to 105 CFU/g of soil when growing from sowing to wheat seedling stage. GFPK3 was further decreased to about 103 CFU/g of soil at harvest time. Bands of DGGE and similarity coeff

22、icient of soil microbial populations showed that the microbe diversity of treatments of the bio-organic fertilizer with GFPK3 (M+GFPK3) and the bio-organic fertilizer with GFPK3 plus P addition (M+I/3P+GFPK3) were more plentiful than the control, revealing that the phosphate solubilizing bacterium h

23、ad remarkable effect on the microbial community in soil. 4. Pot experiments were conducted with maize growing in three types of soil to investigate the colonization of GFPK3 on rhizosphere soil in greenhouse. The results showed that the population of GFPK3 in the sandy soil was more than that in the

24、 silt soil and the sand-silt mixed soil. The number of GFPK3 in the silt soil was dramatically decreased to 104 CFU /g of soil 42 days after sowing. However, in the sandy and the sand-silt mixed soil, the population of GFPK3 was about 105 CFU/g of soil at the same time, then declined to 104 CFU/g of

25、 soil. The results suggested that manure inoculation with GFPK3 could enhance the available phosphate content in soil and significantly promote the maize biomass and phosphoms content in plant. 5. Experiment about the effect of different organic manure on colonization of GFPK3 in soil was conducted

26、in greenhouse. The results showed that GFPK3 was able to grow and colonize under various organic manure addition. The population of GFPK3 in amino manure was highest than the other treatments. The total population of GFPK3 strain decreased from 106 CFU/g of soil at 7th day to 105 CFU/g of soil at 56

27、th day after sowing. Results from root scanning showed that inoculation of K3 could enhance the total root IV ABSTRACT length and root surface area, which improves plant nutrition and plant growth. KEY WORDS： phosphate solubilizing bacteria; character of phosphate-solubilization; wheat; maize; colon

28、ization 第一章文献综述 第一章文献综述 1.0 前言 磷是生物圈中的重要化学元素之一，磷在所有生命系统的代谢过程中其关键作 用。它是生物能量转运载体一 ATP 和 ADP 的重要组成部分。磷素对于植物生长来说， 是仅次于氮素的最重要元素之一。磷不仅是植物体内许多重要有机化合物的组分，还 参与植物多种生命活动，包括能量转化、光合作用、糖分和淀粉的分解等 49。植物吸 收磷素主要来源于土壤，然而，大多数土壤有效磷含量很低，土壤中 95%以上的磷为 难溶形态，植物很难吸收利用。施入的磷肥大部分很快发生专性吸附和化学沉淀而被 固定，所以磷肥当季植物利用率只有 5%-25%63。 据统计，从 1

29、949 年到 1992 年间，中国累计施入农田的磷肥有 7880.9X104t(P2O5)， 其中大约有 600 Xl 4t (P205)积累在土壤中没有被利用 64。我国有 74%的耕地土 壤缺磷，但是很多土壤全磷含量却很高，据张福锁 76等资料，对我国黄土高原 7 省区 的调查，土壤有效磷含量平均为 6 mg P/kg， 而全磷量则达到 1 230 mg P/kg， 为有效 磷的 205 倍。主要是固定态磷溶解度低，无法满足一般作物生长需求，所以土壤缺磷 是 遗传学缺磷 而非 土壤学缺磷 。另一方面，面对土壤缺磷及磷肥利用率低的 状况，粮食的大幅增产总是伴随着磷肥的大量使用，随之而来还有大

30、范围的农业面源 磷污染 66 76。增施磷肥是一种 高投入，低产出 的途径，不仅造成了磷素资源的 大量浪费，严重影响了磷肥工业的可持续发展。同时，磷是一种不可再生资源，根据 目前己探明的磷矿储量和幵采速度，世界现有的磷矿资源只能维持100 年左右，而且 我国的磷肥资源匮乏，生产能力难以满足需求。按照国家发改委的要求， 十一五 末我国磷肥产量将达到 1500 万吨，预计磷矿的总需求要达到 6500 万吨，而我国高品 位磷矿只能满足到 2013 年。国土资源部已 将磷矿列为 2010 年后不能满足中国国民经 济发展要求的 20 个矿种之一。因此，如何开发和有效利用这部分被土壤固定的磷， 如何挖掘土

31、壤潜在的磷库资源，降低磷肥的用量，提高磷的利用率，一直是植物营养 研究的一个热点问题，也是我国可持续农业中必需解决的问题之一。 1.1 土壤中的磷 1.1.1 土壤中磷的形态和含量 通常把土壤磷素分为无机态磷和有机态磷两大类。矿质土壤以无机磷为主，有机 磷约占全磷的 20%-80%。土壤有机磷化合物主要包括四种：植素类、核酸类、磷酯类 和其他有机磷化合物。其中植素磷占土壤有机磷的 40%-80%，核酸类的有机磷占土壤 解磷菌 K3 的溶磷特性及 -其在不同土壤中定殖研究 有机磷的 10%以下，磷脂、磷酸化糖占有机磷的 1%以下。由于土壤有机磷大部分都 是以高分子形态存在，有效性不高，因此处上述

32、几种已知结构的有机磷以外，还有 50% 的有机磷的组分和作用不清楚 68。 土壤中无机态磷大致可分三种形态：水溶态、吸附态和矿物态。水溶态磷除了解 离或者络合的磷酸盐外，还包括部分聚合态磷酸盐。吸附态是指吸附在粘土矿物、有 机物表面的以物理能级、化学键能级或介于这两者能级间的磷 67，可分为阴离子交换 吸附和配位吸附，其中阴离子交换吸附是以静电引力为基础的，而配位吸附 （ 又称专 性吸附 ） 是指磷酸根离子与土壤胶体表面上金属原子的配位壳中的 Off 或 H2O 配位体 进行交换，而被吸附在胶体表面与 H_进行的交换，土壤胶体电荷不变，而与 H20 配 位体进行交换后土壤胶体表面负电荷增加 6

33、1。 矿物态磷主要有原生矿物和次生矿物二种类型。原生矿物主是要有氟磷灰石，羟 基磷灰石和碳酸磷灰石，土壤中三者混存，单独一种存在的土壤很难找到 68。次生矿 物主要是指化合态即沉淀态的磷酸盐，它可分为闭蓄态和非闭蓄态二种类型。必蓄态 磷指磷酸铁和磷酸铝被氧化铁胶膜所包蔽，其活性低，供磷能力弱。如晶形的粉红磷 铁矿。非必蓄态磷酸盐包括磷酸铝、磷酸铁、磷酸三钙，它们在一定的条件下可逐渐 释放出可溶性磷。在我国南方的砖红壤中，非必蓄态的磷以磷酸铁为主，磷酸铝和钙 盐较少，而必蓄态的磷酸盐占无机磷量的 80%。在北方黄壤中，非必蓄态的磷酸钙占 无机磷量的 60-85%，磷的铁和铝盐极少（ 矿化速率），

34、则微生物从介 质中吸收无机磷。 有机磷化合物中植酸是较难分解的，它容易与土壤中的钙、镁和铝离子结合形成 更加难溶的物质。植酸酶能够降解肌醇六磷酸或它们的钙镁盐，释放出磷酸和肌醇。 植酸即肌醇六磷酸，如果在土壤中找到少于六个磷原子的肌醉磷酸盐，就可以认为肌 醇六磷酸盐的分解已经发生。 磷酸酶是一个系统名称，代表一组可催化磷酸酐或磷酸酯水解的酶，其中研究最 为深入的是磷酸单酯水解酶。根据其最适 pH 值又可分为酸性磷酸单酯水解酶 (EC3 丄 3 么简称为酸性磷酸酶）和碱性磷酸单酯水解酶 （ EC3 丄 3 丄简称为碱性磷 酸酶），前者分布于酸性土壤中而后者在碱性土壤中占优势 1()， 25。已有

35、报道证实植物 根系、土壤细菌和真菌 等微生物都能分泌胞外鱗酸酶 9 51， TarafdarandMarschner52 认为接种菌根真菌可以增加土壤磷酸酶活性，相反， Azcan2等在熏衣草上的试验得 出接种菌根真菌降低了酸性磷酸酶活性的结论，而 J ner26认为，菌根对土壤磷酸酶 活性没有影响。钟传青 74研究了不同种类解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的变 化，发现不同种类磷酸盐或磷矿粉对微生物磷酸酶活力的影响不同，贫磷条件可以促 进酸性和碱性磷酸酶活性。 随着分子生物学技术的发展，人们对有机解磷菌的研究也进入了分子水平，特别 是对降解机理和遗传特性方面进行了更为深入的研究。 Thalle:r5()等人报道细菌非特异 性磷酸酶（ NASAPs)主要由三个分子家族组成，分别是 A， B, C。 从它们所处的细 胞位置来看，这些酶主要功能是裂解磷酯键，从而为细胞提供磷素。 &(也 9等人 报道了利用含有 A 家族的非特异性磷酸酶 （ NASAPs)的微生物成功降解了含铀废水。 可见，有机磷降解菌在污水处理，生物除磷方面也有很大的应用前景。 1.2.2 解磷菌在土壤