液相色谱柱的选择和方法开发.pptx

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1、内容概要色谱基本概念回顾色谱柱类型、选择和方法开发制备液相混合固定相-优化复杂样品分离的一个新策略如何改善强水溶性化合物的保留和分离第1页/共99页色谱基本概念回顾色谱基本概念回顾第2页/共99页色谱（chromatography）色谱原理色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相色谱功能：分析（种类/定量），纯化液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）第3页/共99页幻灯片制作：WSY18分离度 Rs-Resolution N Theoretical Plate Number Selectivit

2、y k Retention Factor拖尾第4页/共99页幻灯片制作：WSY181.Separation of Compounds A and B第5页/共99页灵敏度：LimitofDetection：LimitofQuantification柱效峰形（拖尾因子）第6页/共99页重现性分离度（）保留时间（，）选择性（）柱效（）灵敏度第7页/共99页色谱柱类型、选择和方法开发第8页/共99页色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响分离度-选择性键合类型，基质表面特性；流动相、温度-柱效保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相，温度，上样量，流速峰对称性基质表面特性，键合类型，流动相，温度保留体积柱

3、长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度灵敏度粒径，基质表面特性，键合类型；流动相，温度稳定性和重现性基质表面特性，键合类型；流动相，温度流动相pH，缓冲盐种类，溶剂；第9页/共99页影响色谱柱性能的主要因素1、色谱柱的构型 色谱柱内径 色谱柱长度2、固定相柱填料 粒径 比表面积 孔径 孔隙率 基质表面特性：-表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量 -耐碱性 键合类型 -官能团、是否封尾 -键合相的保留行为、耐酸性第10页/共99页色谱柱的构型对色谱柱性能的影响色谱柱的构型对色谱柱性能的影响第11页/共99页色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱尺寸 对色谱

4、分离的影响：短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低 长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长 窄径柱(mm)满足检测器和样品量限制 宽径柱(3-7.8 mm)-载样量高，抗污染，寿命 制备柱(内径 10 mm)用于纯化制备第12页/共99页柱填料对色谱柱性能的影响柱填料对色谱柱性能的影响第13页/共99页柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径 硅胶粒径和类型对柱效的影响d硅胶粒径和类型对压力的影响第14页/共99页柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II 目前市场主要可供选择的填料粒径m，m，m 快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪 m 多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo

5、)m，m 普通快速分析m 常规分析颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.第15页/共99页柱填料对C18色谱柱性能的影响：比表面积 l 每克填料的表面积，与粒度，孔径有关l比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)l 根据需要选择合适的比表面积第16页/共99页柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I l 多孔材料的95%以上表面在孔内部l 样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部l 孔径至少是样品流体学直径的4倍l 300孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部第17页/共99页柱填料对C18色谱柱

6、性能的影响：孔径II 由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大条件：C8色谱柱，4.6150mm，A溶剂，0.1%TFA水溶液；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈水中；20min梯度，1030%B；60C，第18页/共99页柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I二羟基萘二羟基萘 Brand W,AQ Column 5m,4.6mm150mm Brand Z,C18 Column 5m,4.6mm150mm Venusil MP C18 5m,4.6mm150mm Brand H,C18 Column 5m,4.6mm150mm Brand U,C18 Column 5m

7、,4.6mm150mm！TF=？流动相：甲醇：水=65：35流速：1 mL/min温度：35检测波长：230 nm 进样量：20 L硅胶纯度金属含量第19页/共99页硅胶基质类型及发展史TypeA：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解/烧结/酸洗杂化及表面杂化整体柱壳层柱第20页/共99页柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II 硅胶纯度金属含量d第21页/共99页固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响残余硅羟基的影响普通硅胶当流动相的 pH 值大于 4.5-5.0 时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾

8、。解决方法封尾双层表面修饰表面杂化第22页/共99页固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响封尾键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率。缺点：不能完全反应（仍有50%的硅羟基未被反应）在pHC3C1，长链之间差别不大 第31页/共99页反相键合相的保留行为不同厂家色谱柱的保留值，选择性与峰型色谱柱：4.6*150mm，流动相：乙腈磷酸钾缓冲液，pH3.2(65:35);流速：1ml/min，拖尾峰 T0（尿嘧啶）P:吡啶L:苯酚N:N,N-二甲基苯胺B:4-丁基苯甲酸J:甲苯第32页/共99页固定相对色谱柱性能的影响：基质表面特性+键合类型 键合

9、相的稳定性键合相的稳定性 低pH值，键合相流失 高pH值，硅胶溶解影响色谱柱寿命，方法不重现 第33页/共99页键合类型对键合相稳定性影响低pH值，键合相流失第34页/共99页键合类型对键合相稳定性影响（II）空间位阻保护，延缓键合相流失空间位阻键合代表产品：Venusil ASB C18Zorbax SB C18第35页/共99页固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性高pH值，硅胶基质溶解pH9时，色谱柱的稳定性第36页/共99页固定相对色谱柱性能的影响：键合硅胶的稳定性碳杂化，延硅胶缓高pH值水解表面碳杂化Agela Durashell RPPhenomenex Gemini杂化颗粒：

10、Waters Xterra表面碳杂化示意图第37页/共99页pH=12 条件下的稳定性4 amines,ACN/1%Ammonia aqueous=25%:75%,40oC,4.6 x 150 mm,5um 1h200 h第38页/共99页总结：如何选择色谱柱和相应的色谱条件了解目标化合物的性质：结构（官能团）、pKa、分子量、浓度范围、溶解度、极性了解色谱柱的性质粒径，孔径，比表面积保留强度和柱效；抗污染性基质表面特性，键合类型保留强度，选择性，柱效，对称性，灵敏度，稳定性和重现性选择相应的色谱条件第39页/共99页色谱柱选择（）替代：粒径，比表面，基质表面特性，键合类型相似新方法开发：粒径

11、：2um vs 3um vs 5um（分析时间，灵敏度，仪器，价格，寿命）内径柱长：内径（对分离影响不大，成本）；柱长与粒径相关比表面：（低比表面耐污染，高比表面利于分离）孔径：在满足比表面前提下大孔径较好硅胶基质表面特性：）尽可能使用高纯硅胶；）尽可能使用低酸性硅胶；）当流动相尽可能使用表面杂化；）使用多硅羟基残留，可加强对于极性化合物保留或削弱对于非极性化合物保留键合类型：取决于选择性和流动相要求；具有一定极性的（）可以作为首选尝试；耐酸：选择；耐碱：Durashell 封尾与不封尾：封尾削弱硅羟基影响；不封尾：提高硅羟基影响，增强极性物质保留，降低柱流失。第40页/共99页乙腈水乙腈水乙

12、腈水第41页/共99页混合固定相-优化复杂样品分离的一个新策略第42页/共99页混合固定相的意义系统化的改变选择性，便于优化分离度；使难以在同一固定相上分析的强极性和非极性化合物得以解决降低离子交换柱的保留强度，降低缓冲盐浓度，从而使离子交换柱可以与质谱检测器相匹配第43页/共99页混合相比例与保留时间曲线第44页/共99页abc色谱条件250;2 ul;Room temp.;样品：Phenol and melamineSCX Fig.aSCX:ASB C18=4：6 Fig.bASB C18Fig.cRt(Phenol)/min2.2323.0073.790Efficiency(Phenol

13、)/Plate5908890311931Rt(Melamine)/min7.3824.7482.082Efficiency(melamine)/Plate13123100176312第45页/共99页通过混合柱改善分离度SCX SCX:ASB C8=9:1(B0014)HPLC conditions：ACN:50 mM KH2PO4=30:70;1.5 ml/min;35;20 uL;Melamine:2 ppm;column:4.6 250 mm;第46页/共99页降低缓冲盐浓度（倍）以用于 SampleMelamine(100ppm)LC Conditions 1250mmLC Condi

14、tions 2ACN:10 mM KH2PO4=80:20;1.5ml/min;240nm;5ul;5um,300A,4.6250mmFig.a was tested under conditions 1 Fig.b and c were tested under conditions 2abcSCXFig.aSCXFig.bSCX:ASB C18Fig.cRt(Melamine)/min7.06526.9987.577第47页/共99页SPE procedures Fig.aLC Condition Column:Venusil AS-T C18 (SCX/C18）2.1 150mm;5 u

15、m,300 Mobile Phase：ACN:Buffer=50:50;240nm,0.2ml/min,10 ulMass Condition ESI，5KV;Capillary Temp 300,Capillary Voltage 15V;N2 Flow 35 arb;Positive ion detection Scan mode:TIC(MS),TIC(MS/MS);Range(m/z)50140Condition3 ml MethanolEquilibration3 ml WaterLoading10 ml SampleWashing3 ml WaterWashing3 ml Meth

16、anolElution6 ml 5%NH4OH/MethanolConcentrationEvaporate by N2.Dissolve with 1 ml mobile phaseLC-MSa第48页/共99页 标准曲线Precision:RSD=2.83%(n=5)Reproducibility：RSD=4.45%(n=5)Recovery:89.7%RSD=7.3%(n=9)第49页/共99页空白样品 第50页/共99页三聚氰胺标准品第51页/共99页三聚氰胺添加样品第52页/共99页如何改善强水溶性化合物的保留和分离第53页/共99页改进水溶性化合物的保留和分离使用极性反相色谱柱，高

17、水相流动相；调整pH值抑制分析物的离子化。使用离子对试剂，选择低比表面、短链键合相使用HILIC分离技术使用离子交换/反相混合固定相第54页/共99页第55页/共99页第56页/共99页2，-0-甲基-腺嘌呤核苷HPLC方法RT样品峰=18.902min RT主杂质峰=21.024min 主峰与后杂峰（）的分离度R=7.81,主峰后杂峰（）与主要杂质的分离度色谱柱：MP C18 5um 100 4.6*250mm;波 长：260nm;柱 温：30;流 速：流动相：流动相A：甲酸铵溶解于900ml水中，并用甲酸调，再加水使溶液为1L,过滤即得；流动相B：乙腈样 品：流动相A溶解，待分离样品1mg

18、/mL；进 样：5ul梯度表：时间（min）A(%)B(%)01000209010359010351000451000第57页/共99页阿奇霉素有关物质检测空白药典方法样品，100%水 第58页/共99页次黄嘌呤有关物质分析色谱柱：MP C18 5um 100 4.6*250mm流动相：0.1%磷酸氢二钠溶液（磷酸调节pH值至）流 速：柱 温：室温波 长：254nm样 品：样品（水溶解），对照品（客户原液）进 样：5ul第59页/共99页Venusil HILIC(丙酰胺键合相）第60页/共99页键合相，原理和目的丙酰胺键合硅胶已腈水流动相中主要依靠氢键合和电子极化作用，对于多羟基，多氨基，酰

19、胺类和有机酸有很好的保留和分离在弱极性流动相中，对于极性化合物的保留与相似或略低，有利于极性化合物的洗脱水溶液中稳定性明显优于氨基柱或纯硅胶柱第61页/共99页正相条件下与氨基柱比较Test in Traditional Normal Phase ModeColumns:5um,4.6 x 150 mmMobile phaseSample:Toluene,Nitrobenzene,4-Bromoaniline acetate,3-nitroaniline Unisol Amide less polarVenusil NH2第62页/共99页 分离模式N-aceto uracil uracilC

20、olumn:Venusil Silica,5um,4.6 x150 mmMobile Phase:10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV 254 nm第63页/共99页分离模式 N-aceto uracil uracilColumn:Venusil HILIC,5um,4.6 x150 mmMobile Phase:10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV 254 nm第64页/共99页

21、Venusil HILIC(丙酰胺固定相）N-aceto uracilGanciclovirGanciclovirColumn:Venusil Hilic,5um,4.6 x150 mmMobile Phase:10 mmol sodium phosphate(pH7.0)/ACN=35/65Temperature:ambientDetection:UV 254 nm第65页/共99页水溶性维生素分离TimeSamples:VB1,VB6,VC,VB2HPLC ConditionsColumn:Venusil HILIC 4.6 x 150 mm,5umMobile Phase：0.1%TFA

22、:ACN=90:10Det:280nm;Flow:1.0mL/min;Temp:30；Inj:2 L第66页/共99页 Column,5m,4.6mm150mmPart No.:951505-0Brand P,NH2 Column,5m,4.6150mmBrand W Silica Column,5m,4.6150mmMobile Phase:A:0.1%TFA in Water；B:0.1%TFA in AcetonitrileA:B=90:10Flow Rate:1 mL/minTemperature:30Detection:UV280 nmSample:VB1+VB6+VC+VB2 选择

23、性比较VB1+VB6+VC+VB2VC+VB6+VB1+VB2VB1+VB6+VB2+VC第67页/共99页稳定性比较(aging:pH=7,20 mM phosphate buffer/MeOH=40/60;100h)100hVenusil HILIC silica VB1VB2VB1VCVB2VB1VCVB6VB2VB1VB2VB6VB1VB2VB1VB235 h100hNH2 第68页/共99页Decitabine and Impurity AnalysisVenusil HILIC 4.6150mm，5m，ACN：H2O964，1ml/min，UV244nm，room temp.第69

24、页/共99页Analysis of Acarbose and Impurity ACN:KH2PO4(4.4 mmol/L)-Na2HPO4(2.0 mmol/L)=70:30;1.5 ml/min;35;210 nm;Venusil HILIC，5 um，100，4.6 150 mm第70页/共99页Separation of Shikimic Acid(3,4,5,trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic acid Venusil HILIC 4.6 x 250 mm,5um;ACN/1%formic acid 90-60%in 20 min,ambien

25、t temperature,1mL/min,UV210 nm第71页/共99页Comparison:ValidamycinAtlantis-C18(AQ),4.6 x 250 mm,TFA 1%Venusil HILIC,4.6 x 250 mm,ACN/water 85-40%in 30 min,UV 210nm第72页/共99页博纳艾杰尔科技及其产品介绍汪群杰第73页/共99页Who is America-gel-Asia Technologies?2004成立于美国特拉华州，开发和生产液相色谱填料和色谱柱2005年成立北京艾杰尔科技有限公司，负责艾杰尔科技产品的中国和亚洲市场开发2007

26、年在天津滨海新区成立博纳艾杰尔科技有限公司，投资近2000万，建立中国最大色谱分离材料研发和生产基地；产品扩充到5大类，上千个规格2008销售额3400万；2009年目标5000万；第74页/共99页核心业务核心业务分离材料分离材料固相萃取固相萃取色谱纯化色谱纯化色谱纯化色谱纯化GPCGPCHPLCHPLC分析分析生物分离生物分离生物分离生物分离手性分离手性分离手性分离手性分离解决解决方案方案固相萃取和色谱固相萃取和色谱分离纯化设备分离纯化设备第75页/共99页创新成就梦想创新成就梦想!全球最大色谱柱研发团队之一：归国博士4名；硕士12名，本科11名开发色谱相关设备和材料5大类（液相色谱柱、固

27、相萃取柱、快速纯化柱、全自动制备色谱仪、固相萃取仪），近百个系列，上千个规格的商业化产品；申报专利11个（其中2个已获授权）2006年10月成功主标科技部十一五重大支撑项目项目中的课题四“高性能色谱填料和色谱柱的研制”；成功参标科技部十一五重大项目科研试剂项目中“固相萃取材料的研制与开发”入围天津市2009年15个自主创新重大专项基质厂家键合厂家填装厂家销售公司我们在这儿！第76页/共99页不断完善的质量保证体系不断完善的质量保证体系 -充分的技术投入以打造坚实的技术基础-质量方针：质量第一、全员参与；满足客户，不断进取-全方位质量控制体系：研发、原材料供应、生产工艺、质量检验、跟踪/反馈-2

28、007年10月成功获得ISO9001质量认证-2007年分别通过美国第一大和 第二大集成供货商THERMO Fisher 和VWR公司的现场考核 第77页/共99页全球一体化的研发、生产、销售和服务公司分布：Newark,Delaware,USA：研发和销售中心天津：2600m2研发、生产和物流中心国内办事处：北京、上海、广州、杭州、南京、济南、郑州、沈阳全球销售渠道和客户：-26 代理商遍布全球五大洲，包括美国、加拿大、日本、法国、德国、印度、韩国、泰国、巴西、南非等。-VWR（全球第二大实验室设备和耗材供应商）的6大色谱产品供应商之一 -全球客户包括著名仪器厂家Thermo；著名制药企业

29、默克（默沙东）、莉莱、Amgen、Sanofi、Shering-Plough；著名制药技术服务公司 考文斯、XenoBiotek、QPS、Frontage Labs。第78页/共99页第79页/共99页客户评价客户评价Merck“theASBC18columnoutperformedanyothercolumnIcouldgetmyhandsonandIwasabletohandlethehundredsofCOMTcompoundsIwaspresentedwith.”McClainRayT.,Ph.DMerck&Co.,IncFriday,March20,2009第80页/共99页客户评价

30、客户评价Covance“ItestedformycompoundandfoundabetterSensitivityforASBC18columnthanregularlunaC182.150mm,5um.”XiaorongLiang,Ph.DStaffScientistCovanceLaboratoriesInc.Thu,Mar19,2009第81页/共99页从样品前处理到分析、制备的全线产品从样品前处理到分析、制备的全线产品第82页/共99页 中压制备系统及制备柱中压制备系统及制备柱CHEETAHFS-1第83页/共99页20102010年即将建成的研发生产基地年即将建成的研发生产基地第8

31、4页/共99页博纳艾杰尔色谱柱关键技术和系列产品介绍第85页/共99页关键技术硅胶基质制备和表面改性技术：-UNISOL硅羟基取活技术-表面杂化技术键合技术和独特固定相：-成熟可控的横向交联键合工艺，大位阻硅烷键合工艺，混合键合工艺，手性柱表面涂敷工艺-MP-C18；ASB系列；Durashell系列；丙酰胺（VenusilHILIC）；XBP-C18（2）；手性柱色谱柱装填技术：-各类固定相（反相、正相、离子交换）；尺寸（）-混合固定相装填技术第86页/共99页主要色谱柱产品尺寸规格：快速分析柱、分析柱、制备柱固定相-反相-正相-HILIC系列-离子交换-混合固定相（Optimix）-体积排

32、阻-高聚物第87页/共99页与多层结构相关的新型固定相Unisol C18:Venusil ASB C18,Unisol Amide:Durashell RP第88页/共99页Agela Unisol C18具有高度适用性的反相色谱柱极性化合物保持良好的对称峰形LC-MS极高的灵敏度显著增强的对极性化合物的保留和分离能力100%水流动相兼容对生物基质的耐受性宽pH范围(1.5-9.0)第89页/共99页碱性化合物优良的对称峰形1.Uracil2.Pyridine3.Butylparaben4.Naphthalene5.Acenaphthene6.Amitriptyline Column:Uni

33、sol C18,4.6 x 150 mm,5uMobile phase：MeOH：NaH2PO4/Na2H PO4（）=70：30Temp.：30Detection：254 nm Injection：10 LPlate=12046第90页/共99页对极性化合物显著增强的保留和分离能力第91页/共99页Fresh Column;Plates:3224After column washing and re-equilibrium in 100%water(0.1%formic acid);Plates:3045After 500 sample injections;Plates:2810Sampl

34、e:uridine of calf blood plasm(dilute 20 times with 0.1%formic acid)Injection:1uLColumn:Unisol C18 2.150mm,5m FlowMobile phase:0.1%formic acid solution(100%aqueous phase)Injection frequency：500/8min,After 500 injection,wash with methanol/0.1%formic acid solution=50/50 for 30mins，column temperature 40

35、;rinse with 95%MeOH for 30mins,column temperature 45 良好的生物基良好的生物基质耐受性耐受性第92页/共99页Venusil ASB-C18极性C18pH范围0.8-7.0(pH=1,100oC下仍稳定)无封尾C18,150 A,200 m2/g(compared to Zorbax 80A,180m2/g)硅羟基 (compared to Zorbax pH=3.5)100%水流动相兼容(compared to Zobax SB,non-compatible)LC-MS 高灵敏度:比多数C18固定相高2-3 倍(low bleed,iner

36、t surface and high efficiency)第93页/共99页碱性化合物显著改善的峰形Test conditions:Column dimension:4.6 mm x 150mmSample:doxepin,nortriptyline,trimipramine amitriptylineMobile phase:Acetonitrile/0.01M sodium phosphate(pH=6)=70/30Temperature:30 oCFlow:1 mL/minDetection:UV 254 nmBrand A C18(non-endcapped,)C18(non-end

37、capped,twin-layer第94页/共99页Agela Venusil ASB C18,2.150mm,5mAglent Zorbax XDB C18,2.150mm,5mPhenomenex Luna C18,2.050mm,5m LC-MS 灵敏度比较0.01 ng/mL 伪麻黄碱Best S/N:X2-3 sensitivity comparing to other columns第95页/共99页Unisol Amide-一种新型 亲水正相色谱柱硅胶基质的新型酰胺键合色谱柱：1-对水溶性化合物更强的保留和分离能力2-比硅胶柱和氨基柱具有更好的稳定性第96页/共99页Durashell RP独特的键合结构pH范围1-12良好的表面惰性超高载样量第97页/共99页pH=10Durashell RP 5um,4.6 x 150 mmMethanol:aqueous ammonia（pH=10）=65:35;1.0 ml/min;254 nm;30;5 uL1-Uracil 2-Pyridine 3-Paraben 4-Propanolol 5-Naphthalene 6-Acenaphthene7-Amitriptyline第98页/共99页感谢您的观看！第99页/共99页