生化实验课件实验八聚合酶链反应.ppt

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1、聚合酶链反应聚合酶链反应PCR目的n n掌握聚合酶链反应的原理和方法原理原理n nPCRPCR技术实际上是在模板技术实际上是在模板技术实际上是在模板技术实际上是在模板DNADNA、引物和、引物和、引物和、引物和4 4种脱氧核糖核苷种脱氧核糖核苷种脱氧核糖核苷种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于酸存在的条件下依赖于酸存在的条件下依赖于酸存在的条件下依赖于DNADNA聚合酶的酶促合成反应。聚合酶的酶促合成反应。聚合酶的酶促合成反应。聚合酶的酶促合成反应。n nPCRPCR反应分反应分反应分反应分3 3步步步步:n n变性变性变性变性:通过加热使通过加热使通过加热使通过加热使DNADNA双螺旋的氢键断

2、裂，双链解离形成双螺旋的氢键断裂，双链解离形成双螺旋的氢键断裂，双链解离形成双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链单链单链单链DNADNA，n n退火：退火：退火：退火：当温度突然降低时，使引物和其互补的模板在局当温度突然降低时，使引物和其互补的模板在局当温度突然降低时，使引物和其互补的模板在局当温度突然降低时，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，部形成杂交链，部形成杂交链，部形成杂交链，n n延伸：延伸：延伸：延伸：在在在在DNADNA聚合酶和聚合酶和聚合酶和聚合酶和4 4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及种脱氧核糖核苷三磷酸底物及种脱氧核糖核苷三磷酸底物及种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg Mg 2+2

3、+存在的条件下，存在的条件下，存在的条件下，存在的条件下，5533的聚合酶催化以引物为起始的聚合酶催化以引物为起始的聚合酶催化以引物为起始的聚合酶催化以引物为起始点的点的点的点的DNADNA链延伸反应，链延伸反应，链延伸反应，链延伸反应，n n以上以上以上以上3 3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下步为一个循环，每一循环的产物可以作为下步为一个循环，每一循环的产物可以作为下步为一个循环，每一循环的产物可以作为下个循环个循环个循环个循环的模板；数小时之后，介于两个引物之间的特异性的模板；数小时之后，介于两个引物之间的特异性的模板；数小时之后，介于两个引物之间的特异性的模板；数小时之后，介于两

4、个引物之间的特异性DNADNA片片片片段得到了大量复制，数量可达段得到了大量复制，数量可达段得到了大量复制，数量可达段得到了大量复制，数量可达2102106-76-7拷贝。拷贝。拷贝。拷贝。实验步骤n n一、一、PCRPCR反应体系反应体系双蒸水双蒸水双蒸水双蒸水18.518.518.518.5 llll模板模板模板模板1 1 1 1 llll引物引物引物引物1 1 1 10.50.50.50.5 llll引物引物引物引物2 2 2 20.50.50.50.5 lllldNTPdNTPdNTPdNTP1 1 1 1 llllbufferbufferbufferbuffer2.52.52.52.

5、5 llllTaqTaqTaqTaq酶酶酶酶1 1 1 1 llll总体积总体积总体积总体积25252525 llllTag酶：放在写着酶：放在写着“T”字小管，每管内装字小管，每管内装10l模板：放在写着模板：放在写着“模模”字小管字小管加最后一个试剂时多吹加最后一个试剂时多吹吸几次混匀吸几次混匀 二、二、PCR反应循环设置反应循环设置n n94 4minn n94 30secn n55 30sec 25cyclesn n72 30secn n72 5min三、电泳鉴定vvMarker:Marker:1l DNA1l DNA染料染料染料染料 2l 2l 上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液 9l9l DNA DNA MarkerMarkervv样品样品样品样品:1l DNA1l DNA染料染料染料染料 2l 2l 上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液上样缓冲液 9l9l 扩增后扩增后扩增后扩增后DNADNA样品样品样品样品v电泳电压电泳电压电泳电压电泳电压:110-120V:110-120V，约，约，约，约3030分钟分钟分钟分钟vDNA MarkerDNA Marker为为为为D2000D2000实验结果观察本次实验模本次实验模板在板在400-500bp位置位置 本次实验模板为大肠杆菌位置在400-500bp实验报告实验报告一、原理一、原理二、操作二、操作三、结果三、结果