液相色谱中学习.pptx

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1、主要内容主要内容按分离机理的层析分类12凝胶柱效测定3离子交换色谱的原理与操作4凝胶色谱的分离原理与操作第1页/共52页一.按分配机理的层析分类 凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱 离子交换色谱离子交换色谱 反相色谱反相色谱 疏水色谱疏水色谱 亲和色谱亲和色谱第2页/共52页离子交换剂（离子交换剂（P143P143）高分子类交换剂：Sephadex,Sepharose,BioGel,Cellulose等三.离子交换色谱的分离原理与操作第3页/共52页第4页/共52页第5页/共52页第6页/共52页常用的离子交换树脂常用的离子交换树脂常用的离子交换树脂常用的离子交换树脂 强酸性阳离子交换树脂：活性基团是强

2、酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SOSO3 3H H（磺酸基）磺酸基）和和-CHCH2 2SOSO3 3H H（次甲基磺酸基）；次甲基磺酸基）；弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH,-COOH,-OCHOCH2 2COOH,CCOOH,C6 6H H5 5OHOH等弱酸性基团；等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基甲胺基或二甲基-羟基乙基胺基；羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；性较弱；第7页/共5

3、2页DEAE anion exchanger第8页/共52页CMC Cation Exchanger第9页/共52页第10页/共52页2）、性能评价）、性能评价A 交交换换容容量量(exchange capacity)指单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数(mmol)，是表征交换剂离子交换能力的主要参数。B交换容量的测定交换容量的测定对对于于阳阳离离子子交交换换剂剂：用HCl将其处理成氢型，称重并测定其含水量；称数克交换剂，加入到过量已知浓度的NaOH溶液，发生交换反应待反应达到平衡后(强酸性的需要静置24h，弱酸性的需静置数日)，测定剩余的NaOH摩尔

4、数，就可求得阳离子交换剂的交换容量。对于阴离子交换剂：将阴离子交换剂转换成Cl型后，取一定量的Cl型交换剂，通入Na2SO4,用铬酸钾作指示剂，用硝酸银溶液滴定流出液的Cl-，根据Cl-量计算交换容量。蛋白质的交换容量：比小分子化合物要小的多(见表)。Why?第11页/共52页1st 树脂孔道的空间排阻作用大；2nd 交换后排阻其他蛋白质的扩散和交换；3rd 蛋白质的多电荷与多个交换中心结合第12页/共52页ionexchangechromatography（IEC）定义：利用离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。三.离子交换色谱的分离原

5、理与操作第13页/共52页One protein ,PI=6.9 If in the buffer,pH=5.9One protein ,PI=6.9 If in the buffer,pH=7.9anionexchangerscationexchangers交换剂的选择?(p146)分离物质为两性离子,应根据其在稳定的稳定的pHpH范围范围内所带电荷来选择交换剂.第14页/共52页第15页/共52页strongionexchangers适用的pH范围很广,常用来制备无离子水,分离在极端pH溶液中解离且较稳定的物质lweakionexchangers-适用的pH范围窄,但在pH为中性的溶液中交

6、换容量也高,用于分离生命大分子物质,活性保持。第16页/共52页离子交换层析的基本步骤平衡平衡上样吸附上样吸附洗脱洗脱再生再生第17页/共52页+-anion exchange beadEquilibration第18页/共52页Sample applicationand wash-+-第19页/共52页Elution-+-第20页/共52页Regeneration-+第21页/共52页Sampleapplicationand washElutionEquilibrationRegeneration-+-动画第22页/共52页层析柱平衡层析柱平衡缓冲液的用量至少为柱体积的缓冲液的用量至少为柱体

7、积的 2 2 倍倍平衡缓冲液的流速可平衡缓冲液的流速可略高略高于正常操作流速于正常操作流速平衡终点以流出液的平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、离子浓度、导电性、pHpH值值与缓冲液一致为准，其中与缓冲液一致为准，其中pHpH值最重要值最重要第23页/共52页样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高第24页/共52页洗脱1st恒定洗脱缺点：洗脱体积大,溶质洗脱不尽第25页/共52页2nd 线性梯度洗脱(linear gradient elution)线性梯度洗脱的优缺点优点：流动相离子强度I、pH连续变化，不易出现

8、干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器。第26页/共52页3rd阶梯洗脱法(stepwiseelution)优点：无须特殊设备，操作简单；缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象。第27页/共52页样品洗脱样品洗脱1.一般用在工艺摸索初期，能快速的得到目的蛋白和杂蛋白的洗脱性质，减小配一系列盐浓度的工作量。2.根据线性梯度洗脱的结果，采用最佳的阶段洗脱方式。第28页/共52页第29页/共52页离子交换色谱在操作上的注意之处离子交换色谱在操作上的注意之处注意各种厂家提供柱材料的注意各种厂家提供柱材料的pH范围；注意流范围；注意流速范围（压力范

9、围），以免损坏胶颗粒。速范围（压力范围），以免损坏胶颗粒。注意装柱（均匀，无气泡），保养（高盐再注意装柱（均匀，无气泡），保养（高盐再生）及贮存（加防腐剂）。生）及贮存（加防腐剂）。准备样品使其处于与平衡缓冲液相同的准备样品使其处于与平衡缓冲液相同的pH及及离子强度的环境之中，注意样品的溶解性，离子强度的环境之中，注意样品的溶解性，不要有沉淀产生及颗粒物质不要有沉淀产生及颗粒物质;样品中应该避免样品中应该避免含有去污剂及尿素、硫脲等。含有去污剂及尿素、硫脲等。样品总量不应超过柱的结合容量样品总量不应超过柱的结合容量,上样体积一上样体积一般无特殊的限制。般无特殊的限制。第30页/共52页在位清洗

10、和在位消毒在位清洗（除去柱床的沉淀蛋白和顽固蛋白）除脂类、疏水蛋白的方法：使用递增式梯度以410 CV 70%乙醇或30%异丙醇洗柱，再用至少3CV蒸馏水过柱；或以0.5%非离子性去污剂（溶于1mol/L乙酸中）洗柱，再用5CV 70%乙醇过柱，最后用410CV蒸馏水加以清洗。注意：亲和层析介质在位清洗方法需参见包装说明书第31页/共52页在位消毒（将微生物感染降到最低）方法：用0.51mol/L氢氧化钠以该凝胶的建议流速洗柱，约0.51h 然后以最少3CV平衡缓冲液过柱 第32页/共52页优点处理量大，浓缩，高速；选择高，所需柱长较短；回收率高；离子交换剂种类多，价格也远低于亲和吸附剂。IE

11、C特点缺点IEC的操作变量远多于GFC，影响分离特性的因素非常复杂。第33页/共52页二二.离子交换色谱的应用离子交换色谱的应用分离纯化（分离纯化（通用性；高选择性）第34页/共52页由于蛋白质是两性电解质，在不同的由于蛋白质是两性电解质，在不同的pHpH值下，其解值下，其解离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也离程度是不同的，因此既可以采用阳离子交换，也可以用阴离子交换，可视具体情况而定可以用阴离子交换，可视具体情况而定 由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用由于蛋白质的极性基团很多，为了避免洗脱困难，通常采用弱阳或弱阴弱阳或弱阴离子交换离子交换剂剂 适当调节缓冲溶液的适

12、当调节缓冲溶液的pHpH值，使蛋白质适当解离，通常采用的值，使蛋白质适当解离，通常采用的pHpH值靠近其等电点值靠近其等电点（不是等电点）（不是等电点）操作要点操作要点 第35页/共52页一、原理与操作1疏水性相互作用层析的原理疏 水 性 相 互 作 用 层 析(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。亲水性蛋白质表面均含有一定量的疏水性基团，疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸等)含量较多的蛋

13、白质疏水性基团多，疏水性也大。四四 疏水性相互作用层析疏水性相互作用层析(P155)(P155)第36页/共52页 尽管在水溶液中蛋白质具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷尽管在水溶液中蛋白质具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的作用，但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质表面。这电基团的作用，但总有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基发生疏水性相部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基发生疏水性相互作用，被固定相互作用，被固定相(疏水性吸附剂疏水性

14、吸附剂)所吸附。所吸附。第37页/共52页疏水性吸附剂各种凝胶过滤介质经偶联疏水性配基后均可用作疏水性吸附剂。常用的疏水性配基主要有苯基、短链烷基(c3c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。因疏水性吸附作用与配基的疏水性(疏水链长度)和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基应较疏水性低的配基修饰密度低。一般配基修饰密度在（1040）mo1cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作用不足，密度过大则洗脱困难。第38页/共52页图7-12疏水性吸附剂图中a的末端氨基以及a和b的键合亚氨基显弱碱性，在中性pH范围内带正电荷，因此，这类疏水件吸附剂除疏水性吸附外，还可能存在静

15、电吸附(离子交换)作用。图中c的吸附剂利用醚键结合不引入荷电基团，对蛋白质仅产生疏水性吸附作用。第39页/共52页第40页/共52页2)影响因素影响因素(p156)1st 水化层水化层(hydration shell)tight hydration shell(0.35g water/1g pro)loose hydration shell(2g water/1g pro)2nd ionic strength3rd|pH水 pI|Value|pH水 pI|Value zeta电势 水化层4th 增加亲水性物质离子：SCN-，ClO4-，I-有机物：乙二醇、丙三醇等含羟基物质5th 表面活性剂T

16、ighthydrationshellProteincoreLoosehydrationshell洗脱方法?第41页/共52页3)、洗脱方法、洗脱方法降低离子强度增加|pHpI|乙二醇orI-表面活性剂第42页/共52页2疏水性相互作用层析的操作 吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上，选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温度因素。为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法：改换一种具有较低盐析效应的离子；降低离子强度；增加洗脱剂的极性，也可加入乙二醇；用含有表面活性剂的洗脱剂第43页/共52页每次实验结

17、束后，吸附剂需要再生。因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附容量将明显降低。一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使用。蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结合的顺序是很重要的。疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与凝胶过滤、离子交换层析结合使用。第44页/共52页二、疏水性相互作用层析的应用及特点1st互补工具：HIC主要用于蛋白质类分离纯化，虽然HIC不如IEC的应用广泛，但可以作为IEC的互补工具。如方法得当，HIC与IEC的分离效率相当。2nd与盐析衔接：由于在高浓度盐溶液中疏水性较大

18、，因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3rd可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小，因此可根据目标产物的性质选择适当的吸附剂。4th疏水性吸附的种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。第45页/共52页五五 反相层析反相层析 反相层析(Reversedphase chromatography，RPC)是利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。与前述HIC同样，RPC中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现强烈的疏水性。因此，必须采用极性有机溶剂（

19、如甲醇、乙氰等）或其水溶液进行溶质的洗脱分离。第46页/共52页RPC主要用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性有机溶剂，生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失活。所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。第47页/共52页 溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。例如，烃类化合物的分配系数与其分子所含碳原子数成正比。与其它层析法一样，当固定相一定时，可通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。流动相的极性越

20、大，溶质的分配系数越大。因此RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过硅烷化反应在硅胶表面缝合非极性分子层制备。硅烷化反应式为：第48页/共52页 除硅胶外，高分子聚合物也可作为反相介质的载体，如TSKgelOctodecyl4PW和TSKgelOctadecylNPR(聚丙烯酸酯C18)等。反相介质性能稳定，分离效率高，可分离蛋白质、肽、氨基酸、核酸、脂类、脂肪酸、糖类、植物碱等含有非极性基团的各种物质。因此，RPC做为定量分析手段，广泛应用于科学研究、临床诊断、工业检测和环境保护等各个行业。做为产品纯化制备手段，由于反

21、相介质与其分离的对象相比价格较高，多限于实验室规模的应用，在大规模工业生产中应用较少。第49页/共52页正相色谱(了解)运用极性固定相和弱极性非极性流动相,这种经典的色谱模式被称为正相。反相色谱与疏水色谱的不同在哪几方面(P155)第50页/共52页Heard melodies are sweet,but those unheard are sweeterHeard melodies are sweet,but those unheard are sweeterWho neglects learning in his youth,Who neglects learning in his youth,loses the past and is dead for the future.loses the past and is dead for the future.第51页/共52页感谢您的观看！第52页/共52页