细胞工程学试验.pptx

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1、 实验一实验一 植物细胞培养基的种类及配制一、实验目的一、实验目的1、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。、了解植物细胞培养基的种类及营养要求。2、掌握、掌握MS培养基的配制方法。培养基的配制方法。二、实验材料二、实验材料 1、实验设备：、实验设备：高压灭菌锅、电子分析天平、高压灭菌锅、电子分析天平、pH计、超净计、超净工作台。工作台。2、实验器材：、实验器材：电磁炉、烧杯、量筒、搅拌棒、吸量管、电磁炉、烧杯、量筒、搅拌棒、吸量管、移样枪。移样枪。第1页/共32页三、植物细胞培养基的种类三、植物细胞培养基的种类在在100多年的植物组织、器官和细胞离体培养研究中，研制开发了数十种适宜多年的植物组

2、织、器官和细胞离体培养研究中，研制开发了数十种适宜不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方，但多数培养基是在几种普不同植物、不同组织、不同细胞生长发育的培养基配方，但多数培养基是在几种普遍应用的培养基上演变而来的，其中应用最为广泛的仍为遍应用的培养基上演变而来的，其中应用最为广泛的仍为MS培养基。植物组织培培养基。植物组织培养基早期的建立，如养基早期的建立，如White提出的根培养基和提出的根培养基和Gautheret提出的愈伤组织培养基，提出的愈伤组织培养基，都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。以后所有的各种培养基又都都是由先前的用于整体植物栽培的营养液发展而来的。以后所

3、有的各种培养基又都是在是在White培养基和培养基和Gautheret培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组培养基的基础上形成的。各种培养基在无机营养组成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据无机盐的含量可以分成上的差异主要是盐和离子数量上的不同。常用培养基中根据无机盐的含量可以分为为4类，分述于下：类，分述于下：第2页/共32页1、高无机盐含量培养基：、高无机盐含量培养基：高无机盐含量培养基中，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高无机盐含量培养基中，钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，养分数量及比例较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞高，微量元素种类齐全，养分数量及比例

4、较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。主要有及原生质体的培养。主要有MS培养基和培养基和ER培养基。培养基。2、较高硝酸钾含量培养基：、较高硝酸钾含量培养基：较高硝酸钾含量培养基适合于木本植物、十字花科较高硝酸钾含量培养基适合于木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有植物和单子叶植物的组织和花药培养。主要有B5培养基和培养基和N6培养基。培养基。第3页/共32页3 3、中等无机盐含量培养基：、中等无机盐含量培养基：中等无机盐含量培养基中，大量元素约为中等无机盐含量培养基中，大量元素约为MS培养培养基的一半，微量元素种类减少，但含量较基的一半，微量元素种类减少

5、，但含量较MS的高，适合于花药培养。主要有的高，适合于花药培养。主要有Nitsch培养基和培养基和NT培养基。培养基。4 4、低无机盐含量培养基：、低无机盐含量培养基：低无机盐量培养基中，大量元素含量大幅降低而且无机盐量培养基中，大量元素含量大幅降低而且种类减少，多数用于生根培养基。主要有种类减少，多数用于生根培养基。主要有White培养基和培养基和Heller培养基。培养基。各种植物培养基的营养组成及配方如下表：各种植物培养基的营养组成及配方如下表：第4页/共32页培养基成分培养基成分培养基（培养基（mg/L）MS（1962）ER（1965）B5（1968）N6（1975）Nitsch196

6、3NT（1971）White（1963）Heller（1953）NH4NO3KNO3CaCl22H2OCaCl2MgSO47H2O1 6501 900 440 3701 2001 900 440 3702 527.50 1502502 830 166 185 720 950 166 185 825 950 220 1 233 80 750 75 250KH2PO4（NH4）2SO4Ca（NO3）24H2ONaNO3Na2SO4 170340 134 400 463 68 680 300 200600NaH2PO4H2OKClKIH3BO3MnSO44H2O 0.83 6.20 22.30 0.

7、63 2.23 150 0.75 3.00 0.80 1.60 4.40 10.00 25.00 0.83 6.20 22.30 19.00 65.00 0.75 1.50 5.00 125 750 0.01 1.00 0.10MnSO4H2OZnSO47H2OZnSO44H2OZnNa2EDTANa2MoO42H2O 8.60 0.25 15.00 0.025 10.00 2.00 0.25 3.80 10.00 0.25 8.60 0.25 3.00 1.00MoO3CuSO45H2OCoCl26H2OCoSO47H2OAlCl3 0.025 0.0250.0025 0.00250.025

8、 0.025 0.025 0.025 0.03 0.001 0.01 0.030.03NiCl26H2OFeCl36H2OFe2（SO4）3FeSO47H2ONa2EDTA2H2O 27.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.3027.80 37.30 2.50 0.03 1.00肌醇肌醇烟酸烟酸盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇盐酸硫胺素盐酸硫胺素甘氨酸甘氨酸100 0.50 0.50 0.10 2.000.50 0.50 0.50 2.00 100 1.00 1.00 10.00 0.50 0.50 1.00 2.00 1005.00 0.5

9、0 0.50 2.00 100 1.00 0.05 0.01 0.01 3.00叶酸叶酸生物素生物素蔗糖蔗糖D-D-甘露醇甘露醇30 00040 00020 00050 0000.50 0.0520 000 10 000127 00020 000第5页/共32页四、四、MS培养基的配制培养基的配制植物细胞培养基种类很多，如植物细胞培养基种类很多，如MS、ER、B5、N6、NT和和White等。本实验以等。本实验以MS完全培养基为例，介绍植物细胞培养基的配制方法。完全培养基为例，介绍植物细胞培养基的配制方法。（一）（一）MS培养基母液的配制培养基母液的配制母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，

10、单独保存或几种混合保存。配母液的配制是按药品的种类和性质分别配制，单独保存或几种混合保存。配制好的母液种类一般有大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存制好的母液种类一般有大量元素、微量元素、钙盐、铁盐、有机营养和单独保存的各种生长调节类物质。大量元素一般配制成的各种生长调节类物质。大量元素一般配制成10倍浓度的母液，微量元素和有机倍浓度的母液，微量元素和有机物常配制成物常配制成100倍浓度的母液。见下表。倍浓度的母液。见下表。第6页/共32页母 液成 分规定量（mg/L）扩大倍数称取量（mg）母液体积（mL）配1L培养基吸取量（mL）编号种类1大量元素KNO31 9001019 0

11、001000100NH4NO31 65016 500MgSO47H2O3703 700KH2PO41701 7002钙盐CaCl22H2O440104 40010001003微量元素MnSO44H2O22.31002 230100010ZnSO47H2O8.60860H3BO36.20620KI0.8383Na2Mo42H2O0.2525CuSO45H2O0.0252.5CoCl26H2O0.0252.54铁盐Na2EDTA37.301003 730100010FeSO44H2O27.802 7805有机物质甘氨酸2.005010050010盐酸硫胺素0.105盐酸吡哆醇0.5025烟酸0.5

12、025肌醇1005 000第7页/共32页上上表提供了表提供了MS培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大倍培养基母液的配方。将各种化合物按指定扩大倍数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸馏数准确称量、分别溶解后，按先后次序加入蒸馏水中，最后用蒸馏水定容。水定容。注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度，注意：在混合定容时，一定要掌握药剂的先后次序或稀释度，以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应，以免发生沉淀。钙盐和铁盐由于与其它母液混合容易发生沉淀反应，因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利于植物在适宜的因此需单独配制。铁盐为螯合状态时，有利

13、于植物在适宜的pH下吸下吸收和利用，因此需与螯合剂收和利用，因此需与螯合剂Na2EDTA混合配制。生长调节类物质混合配制。生长调节类物质一般分别配制成一般分别配制成0.21.0mg/L的母液，用时按量吸取。某些生长调的母液，用时按量吸取。某些生长调节剂不溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如节剂不溶于水，需用不同溶剂进行溶解，如NAA、2,4-D、IAA、IBA、GA3是醇溶性的，配制时先用少量是醇溶性的，配制时先用少量95%酒精溶解，然后再用酒精溶解，然后再用蒸馏水定溶；蒸馏水定溶；KT、6-BA、2ip、ZT先溶于少量先溶于少量1mol/L盐酸中，然后盐酸中，然后再用蒸馏水定容；叶酸先用少量稀氨

14、水溶解后再定容。再用蒸馏水定容；叶酸先用少量稀氨水溶解后再定容。配制好的各种母液倒入棕色瓶中，贴好标签，保存于配制好的各种母液倒入棕色瓶中，贴好标签，保存于4冰箱冰箱中备用。注意：母液保存于冰箱中的时间不宜过长，一般为中备用。注意：母液保存于冰箱中的时间不宜过长，一般为12个个月，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能再使用。月，当母液出现沉淀或霉菌团时，则不能再使用。第8页/共32页（二）（二）MS完全培养基的配制完全培养基的配制以配制以配制1 000mL MS1 000mL MS完全培养基为例，配制全过程如下：完全培养基为例，配制全过程如下：1、在洁净的不锈钢（或搪瓷）容器中加入、在洁净的不锈钢

15、（或搪瓷）容器中加入1/2终体积终体积（500mL）的蒸馏水；）的蒸馏水；2、按上表内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到、按上表内容规定的量，精确吸取各种母液，依次加入到盛有盛有1/2终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录终体积蒸馏水的不锈钢（或搪瓷）容器中，记录此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同此时的总体积。注意：母液不能混合后加入，也不能同时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌，时加入，必须依次缓慢加入，且要一边加入一边搅拌，以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应；以免造成电解质局部浓度过高而发生沉淀反应；3、根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物

16、、根据培养目的及要求，加入所需量的各种生长调节物质，记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱质，记录此时的总体积（如用于长春花叶愈伤组织的诱导：加入导：加入2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA1.0mg/L、KT0.2mg/L）；）；第9页/共32页4、加入、加入30g蔗糖，蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮（聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP，抗氧化剂，防止或减轻植物组织褐化，也可用一定，抗氧化剂，防止或减轻植物组织褐化，也可用一定量的维生素量的维生素C、活性碳代替，或不加，视情况而定），充、活性碳代替，或不加，视情况而定），充分混匀后，补充蒸馏水

17、至终体积分混匀后，补充蒸馏水至终体积1000mL，然后用，然后用1mol/L盐酸或盐酸或1mol/L氢氧化钠调节培养基至氢氧化钠调节培养基至pH5.8；5、精确称取、精确称取15g琼脂加入其中，在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此琼脂加入其中，在电磁炉上煮沸溶解琼脂。此过程需加以搅拌，防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出；过程需加以搅拌，防止琼脂在锅底烧焦或沸腾溢出；6、琼脂溶解后，及时将培养基分装于、琼脂溶解后，及时将培养基分装于150mL三角瓶中，约三角瓶中，约50mL/瓶，包膜密封，并于瓶，包膜密封，并于100KPa、121下灭菌下灭菌1520分分钟。冷却备用。钟。冷却备用。第10页/共32页注注意意：培

18、培养养基基的的pH直直接接影影响响培培养养物物对对离离子子的的吸吸收收，过过酸酸或或过过碱碱不不仅仅影影响响到到培培养养材材料料的的生生长长，而而且且还还影影响响到到琼琼脂脂的的凝凝固固，pH低低于于5.5时时，琼琼脂脂凝凝固固程程度度不不好好，pH高高于于6.0时时，琼琼脂脂过过度度凝凝固固，培培养养基基变变硬硬，不不利利于于培培养养材材料料对对营营养养物物质质的的吸吸收收及及对对代代谢谢废废物物的的排排放放，从从而而影影响响培培养养材材料料的的生生长长。培培养养基基的的pH可可用用酸酸度度计计测测试试，并并用用1mol/L盐盐酸酸或或1mol/L氢氢氧氧化化钠钠调调整整至至适适宜宜范范围围

19、（1mol/L盐盐酸酸配配制制方方法法：取取12mol/LHCl84mL，加加入入蒸蒸馏馏水水定定容容至至1000mL；1mol/L氢氢氧氧化化钠钠配配制制方方法法：称称40gNaOH，溶溶解解后后加加入入蒸蒸馏馏水水，定定容容至至1000mL）。培培养养的的植植物物材材料料其其生生长长最最适适pH范范围围为为5.66.0，培培养养基基经经高高压压高高温温灭灭菌菌后后，由由于于某某些些成成分分的的降降解解或或氧氧化化，酸酸度度会增加，会增加，pH一般可降低一般可降低0.2，因此配制植物培养基时，通常调整，因此配制植物培养基时，通常调整pH至至5.8。第11页/共32页对对于于某某些些不不能能高

20、高压压高高温温灭灭菌菌的的试试剂剂或或药药品品，必必须须过过滤滤除除菌菌，待待培培养养基基灭灭菌菌后后未未凝凝固固之之前前（4560）加加入入，并并轻轻摇摇使使混混匀匀。这这时时，每每个个培培养养容容器器的的装装入入量量和和过过滤滤除除菌菌后后的的物物质质都都要要事事先先计计算算好好，定定量量加加入入其其中中。植植物物培培养养基基的的配配制制程程序序可可用用流流程程图图表表示如下：示如下：水 药品混匀pH调整琼脂加热溶解糖玻璃器皿水洗干燥分装密封接种冷却高温蒸汽灭菌 第12页/共32页实验实验二二长春花叶片愈伤组织的诱导长春花叶片愈伤组织的诱导一、实验目的一、实验目的通过对长春花叶片愈伤组织的

21、诱导，分析生长素和细胞分裂素对长春花叶片通过对长春花叶片愈伤组织的诱导，分析生长素和细胞分裂素对长春花叶片离体培养的作用，熟练掌握植物组织离体培养培的基本操作技术，了解植物组织在离体培养的作用，熟练掌握植物组织离体培养培的基本操作技术，了解植物组织在离体培养条件下脱分化的条件及特点。离体培养条件下脱分化的条件及特点。二、实验原理二、实验原理根据植物细胞全能性理论，利用根据植物细胞全能性理论，利用MS培养基，加入一定浓度的生长素和细胞分培养基，加入一定浓度的生长素和细胞分裂素对长春花叶片组织进行培养，在光照或黑暗条件下均可诱导长春花叶片组织发裂素对长春花叶片组织进行培养，在光照或黑暗条件下均可诱

22、导长春花叶片组织发生脱分化而产生愈伤组织，这已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些生脱分化而产生愈伤组织，这已经在许多植物的组织培养中得到证实，甚至在一些低等植物（如葫芦藓）中也得到了证实。低等植物（如葫芦藓）中也得到了证实。第13页/共32页三、实验材料三、实验材料1、实验设备：、实验设备：超净工作台、高压灭菌锅、超净工作台、高压灭菌锅、pH计、光照培养计、光照培养箱、暗培养箱。箱、暗培养箱。2、实验器材：、实验器材：三角瓶（三角瓶（150mL）、棕色瓶（）、棕色瓶（100mL，500mL，1000mL）、长柄镊子、塑料烧杯）、长柄镊子、塑料烧杯（500mL，l000mL）、玻璃烧杯

23、（）、玻璃烧杯（100mL、500mL，l000mL）、量筒（）、量筒（100mL，500mL，1000mL）、培养皿（）、培养皿（=12cm）、手术刀。）、手术刀。3、实验试剂：、实验试剂：萘乙酸（萘乙酸（Napthylaceticacid，NAA）、）、6-苄基苄基氨基嘌呤（氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、）、2，4-二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D）、）、KT（kinetin，KT）、升汞（）、升汞（HgCl）、次）、次氯氯酸钠酸钠溶液、溶液、95%酒精、蔗糖（酒精、蔗糖（Sucrose）、琼

24、脂）、琼脂（Agar）、）、MS基本培养基母液。基本培养基母液。第14页/共32页4、试剂配制：、试剂配制：（1）MS基本培养基母液：基本培养基母液：见实验一见实验一MS培养基配方表。培养基配方表。（2）1mol/LNaOH：将将40gNaOH溶解在溶解在1升蒸馏水中，升蒸馏水中，搅拌均匀。搅拌均匀。（3）1mol/LHCl：用蒸馏水将用蒸馏水将12mol/L的浓盐酸稀释的浓盐酸稀释12倍。倍。（4）生长调节剂母液：）生长调节剂母液：0.2mg/mL萘乙酸（萘乙酸（NAA）溶液：）溶液：精确称取精确称取20mg萘乙酸，用少量萘乙酸，用少量1mol/LNaOH溶解后，用蒸馏水溶解后，用蒸馏水稀释

25、并定容到稀释并定容到100ml。0.2mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：）溶液：精精确称取确称取20mg2,4-二氯苯氧乙酸，用少量二氯苯氧乙酸，用少量1mol/L的的NaOH溶解后，用蒸馏水稀释并定容到溶解后，用蒸馏水稀释并定容到100ml。第15页/共32页0.2mg/mL6-苄氨基嘌呤（苄氨基嘌呤（6-BA）溶液：）溶液：精确称取精确称取20mg6-苄基氨基嘌呤，用少量苄基氨基嘌呤，用少量1mol/L的的HCl溶解后，溶解后，用水稀释并定容到用水稀释并定容到100ml。0.1mg/mLKT（kinetin，KT）溶液：）溶液：精确称取精确称取10mgKT，用

26、少量，用少量1mol/L的的HCl溶解后，用水稀释并定容溶解后，用水稀释并定容到到100ml。（5）75的消毒酒精：的消毒酒精：精确量取精确量取75ml无水乙醇溶于无水乙醇溶于100ml蒸馏水中。蒸馏水中。（6）0.1%升汞（升汞（HgCl）溶液：）溶液：精确称取精确称取1gHgCl，用蒸馏，用蒸馏水溶解并定容到水溶解并定容到1000ml，盛装于棕色试剂瓶中避光保，盛装于棕色试剂瓶中避光保存。存。（7）10%次氯酸钠溶液：次氯酸钠溶液：精确量取精确量取100ml次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液溶，用蒸馏水溶解并定容到溶，用蒸馏水溶解并定容到1000ml，盛装于棕色试剂，盛装于棕色试剂瓶中避光保存。瓶中

27、避光保存。5、实验用植株：、实验用植株：长春花幼苗。长春花幼苗。第16页/共32页四、实验步骤四、实验步骤1、MS完全培养基的配制：完全培养基的配制：（1）将各种贮液按比例混合，配制成）将各种贮液按比例混合，配制成MS培养基（具体操培养基（具体操作见实验一）；作见实验一）；（2）分别加入）分别加入2,4-D1.0mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA1.0mg/L、KT0.2mg/L（此激素配方只适用于长春（此激素配方只适用于长春花叶片愈伤组织的诱导。对于不同植物的外植体来花叶片愈伤组织的诱导。对于不同植物的外植体来说，影响其脱分化的激素种类和用量是不一样的，说，影响其脱分化的激素种类和用量

28、是不一样的，必需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）；必需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）；第17页/共32页（3）培养基中加入）培养基中加入3蔗糖，完全溶解后加蒸馏水至终体蔗糖，完全溶解后加蒸馏水至终体积；积；（4）用）用lN的的NaOH调整培养基至调整培养基至pH5.8；（5）加入）加入15g/L琼脂，将培养基置电磁炉上煮沸至琼脂完全琼脂，将培养基置电磁炉上煮沸至琼脂完全溶解，然后分装到溶解，然后分装到150ml三角瓶中，每瓶约三角瓶中，每瓶约70ml，用，用封口膜包扎瓶口；封口膜包扎瓶口；（6）将三角瓶放入高压灭菌锅，于）将三角瓶放入高压灭菌锅，于121、100KPa下灭菌下灭菌15

29、20min。待压力下降为零，温度降低到。待压力下降为零，温度降低到105以以下，打开放气阀排气后，取出三角瓶，平放冷却备用；下，打开放气阀排气后，取出三角瓶，平放冷却备用；（7）按上述方法高压灭菌蒸馏水、空三角瓶、培养皿（带）按上述方法高压灭菌蒸馏水、空三角瓶、培养皿（带滤纸）及其它相关用具。滤纸）及其它相关用具。第18页/共32页2、外植体的表面消毒与接种培养：、外植体的表面消毒与接种培养：（1）取长春花完全展开的幼叶，用自来水流水冲洗）取长春花完全展开的幼叶，用自来水流水冲洗12h；（2）在超净工作台上用无菌水将叶片洗涤）在超净工作台上用无菌水将叶片洗涤23次，每次次，每次1min，然后浸

30、于含，然后浸于含75酒精的无菌三角瓶中轻摇酒精的无菌三角瓶中轻摇30s，再移入再移入0.1升汞溶液中轻摇升汞溶液中轻摇58min或或10的次氯酸钠的次氯酸钠溶液中轻摇溶液中轻摇810min（消除外植体表面的微生物），（消除外植体表面的微生物），无菌水洗涤无菌水洗涤35次（消毒液对外植体有很大伤害，必须次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次清洗干净），每次3min；第19页/共32页（3）将消毒后的长春花叶片置于无菌培养皿内（有无菌滤）将消毒后的长春花叶片置于无菌培养皿内（有无菌滤纸），用手术刀将无菌叶片切成纸），用手术刀将无菌叶片切成5mm5mm大小；大小；（4）将适宜大小的外植体

31、接种到培养基上，每个三角瓶中接）将适宜大小的外植体接种到培养基上，每个三角瓶中接入入34块叶外植体；块叶外植体；（5）将接种好的三角瓶置于光培养箱（光周期为：光照）将接种好的三角瓶置于光培养箱（光周期为：光照16h和黑暗和黑暗8h，光照强度约，光照强度约l500lx左右）或暗培养箱内的培左右）或暗培养箱内的培养架上，培养温度为养架上，培养温度为261；（6）每天观察培养情况，记录结果。如：接种培养后，外植）每天观察培养情况，记录结果。如：接种培养后，外植体（培养材料）在形态学上的变化情况，愈伤组织开始体（培养材料）在形态学上的变化情况，愈伤组织开始出现时间、愈伤组织诱导率、形态、生长速率、颜色

32、变出现时间、愈伤组织诱导率、形态、生长速率、颜色变化及质地等指标。预期结果见图化及质地等指标。预期结果见图2-1。第20页/共32页【思考题】1、影响长春花叶外植体脱分化的条件及特点是、影响长春花叶外植体脱分化的条件及特点是什什么？么？2、对于同一物种的不同组织来说，其愈伤组织、对于同一物种的不同组织来说，其愈伤组织诱诱导条件是否一样？为什么？导条件是否一样？为什么？第21页/共32页实验八实验八植物愈伤组织细胞的传代培养植物愈伤组织细胞的传代培养一、实验目的一、实验目的1、掌握植物愈伤组织细胞传代培养的原理及操作方法。掌握植物愈伤组织细胞传代培养的原理及操作方法。2、了解植物细胞培养的意义。

33、了解植物细胞培养的意义。二、实验原理二、实验原理和动物细胞传代培养一样，植物细胞传代培养也是组织培养的常规保种方法之一，和动物细胞传代培养一样，植物细胞传代培养也是组织培养的常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中培养时，细胞不断生长增殖，是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中培养时，细胞不断生长增殖，培养基中的营养成分逐渐耗尽，同时也积累大量的代谢废物，从而反馈抑制细胞的生培养基中的营养成分逐渐耗尽，同时也积累大量的代谢废物，从而反馈抑制细胞的生长，甚至导致细胞褐化而死。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足，长，甚至导致细胞褐化而死。这时需要进行

34、分离培养，否则细胞会因生存空间不足，营养障碍，生长条件恶化而死亡。细胞由原培养瓶内分离后转到新的培养瓶中继续培营养障碍，生长条件恶化而死亡。细胞由原培养瓶内分离后转到新的培养瓶中继续培养的过程称为传代培养。传代培养可获得大量细胞供实验或生产所需。养的过程称为传代培养。传代培养可获得大量细胞供实验或生产所需。第22页/共32页三、实验材料三、实验材料1 1、实验设备：、实验设备：超净工作台、超净工作台、pH计、高压灭菌锅、生化培计、高压灭菌锅、生化培养养箱。养养箱。2、实验器材：、实验器材：三角瓶（三角瓶（150mL）、棕色瓶（）、棕色瓶（100mL，500mL，1000mL）、长柄镊子、塑料烧

35、）、长柄镊子、塑料烧杯（杯（500mL，l000mL）、玻璃烧杯（）、玻璃烧杯（100mL、500mL，l000mL）、量筒（）、量筒（100mL，500mL，1000mL）、培养皿）、培养皿（=12cm）、手术刀。）、手术刀。3 3、实验试剂：、实验试剂：萘乙酸（萘乙酸（Napthylaceticacid，NAA）、）、6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、）、2，4-二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2，4-Dichlorophenoxyaceticacid，2，4-D）、）、KT（kinetin，KT）、）、95%酒精、蔗糖酒精、蔗糖（Sucros

36、e）、琼脂（）、琼脂（Agar）、）、MS基本培基本培养基母液。养基母液。第23页/共32页 4、生长调节剂母液：、生长调节剂母液：0.2mg/mL萘乙酸（萘乙酸（NAA）溶液：）溶液：精确称取精确称取20mg萘乙萘乙酸，用少量酸，用少量1mol/LNaOH溶解后，用蒸馏水稀释并定溶解后，用蒸馏水稀释并定容到容到100ml。0.2mg/mL2,4-二氯苯氧乙酸（二氯苯氧乙酸（2,4-D）溶液：）溶液：精确称取精确称取20mg2,4-二氯苯氧乙酸，用少量二氯苯氧乙酸，用少量1mol/L的的NaOH溶解溶解后，用蒸馏水稀释并定容到后，用蒸馏水稀释并定容到100ml。0.2mg/mL6-苄氨基嘌呤（

37、苄氨基嘌呤（6-BA）溶液：）溶液：精确称取精确称取20mg6-苄基氨基嘌呤，用少量苄基氨基嘌呤，用少量1mol/L的的HCl溶解后，用溶解后，用水稀释并定容到水稀释并定容到100ml。0.1mg/mLKT（kinetin，KT）溶液：）溶液：精确称取精确称取10mgKT，用少量，用少量1mol/L的的HCl溶解后，用水稀释并定容到溶解后，用水稀释并定容到100ml。第24页/共32页5、75的消毒酒精：的消毒酒精：精确量取精确量取75ml无水乙醇溶于无水乙醇溶于100ml蒸蒸馏水中。馏水中。6、实验材料：、实验材料：长春花叶片愈伤组织细胞。长春花叶片愈伤组织细胞。第25页/共32页四、实验步

38、骤四、实验步骤1、MS完全培养基的配制：完全培养基的配制：（1）将各种贮液按比例混合，配制成）将各种贮液按比例混合，配制成MS培养基（具体操培养基（具体操作见实验一）；作见实验一）；（2）分别加入）分别加入2,4-D0.5mg/L、6-BA0.5mg/L、NAA0.5mg/L、KT0.3mg/L（此激素配方只适用于长春花（此激素配方只适用于长春花叶片愈伤组织细胞的生长。对于不同的愈伤组织细胞叶片愈伤组织细胞的生长。对于不同的愈伤组织细胞来说，影响其生长的激素种类和用量是不一样的，必来说，影响其生长的激素种类和用量是不一样的，必需通过正交试验来筛选才能获得最佳配方）；需通过正交试验来筛选才能获得

39、最佳配方）；第26页/共32页（3）培养基中加入）培养基中加入3蔗糖，完全溶解后加蒸馏水至终体蔗糖，完全溶解后加蒸馏水至终体积；积；（4）用）用lN的的NaOH调整培养基至调整培养基至pH5.8；（5）加入）加入15g/L琼脂，将培养基置电磁炉上煮沸至琼脂完全溶琼脂，将培养基置电磁炉上煮沸至琼脂完全溶解，然后分装到解，然后分装到150ml三角瓶中，每瓶约三角瓶中，每瓶约50ml，用封口，用封口膜包扎瓶口；膜包扎瓶口；（6）将三角瓶放入高压灭菌锅，于）将三角瓶放入高压灭菌锅，于121、100KPa下灭菌下灭菌1520min。待压力下降为零，温度降低到。待压力下降为零，温度降低到105以下，以下，

40、打开放气阀排气后，取出三角瓶，平放冷却备用；打开放气阀排气后，取出三角瓶，平放冷却备用；（7）按上述方法高压灭菌蒸馏水、空三角瓶、培养皿（带滤）按上述方法高压灭菌蒸馏水、空三角瓶、培养皿（带滤纸）及其它相关用具。纸）及其它相关用具。第27页/共32页2、外植体的接种与培养：、外植体的接种与培养：（1）用长柄镊子取新鲜的长春花叶片愈伤组织细胞，接种）用长柄镊子取新鲜的长春花叶片愈伤组织细胞，接种到新鲜培养基表面，每瓶到新鲜培养基表面，每瓶34块（每块愈伤组织的大小块（每块愈伤组织的大小约为约为3mm3mm，重约，重约0.5g）；）；（2）将接种好的三角瓶置于生化培养箱中进行暗培养，培）将接种好的

41、三角瓶置于生化培养箱中进行暗培养，培养温度为养温度为261；（3）每天观察培养情况，记录结果。如：传代培养后，外）每天观察培养情况，记录结果。如：传代培养后，外植体在形态学上的变化情况，愈伤组织细胞的生长速植体在形态学上的变化情况，愈伤组织细胞的生长速率、颜色变化及质地等指标。率、颜色变化及质地等指标。第28页/共32页注注意意：植植物物细细胞胞的的传传代代培培养养常常采采用用新新鲜鲜、疏疏松松、生生长长良良好好的的愈愈伤伤组组织织细细胞胞作作为为外外植植体体，一一般般为为白白色色或或浅浅黄黄色色，用用镊镊子子比比较较容容易易分分离离。但但是是，有有些些植植物物的的愈愈伤伤组组织织细细胞胞生生

42、长长致致密密（如如长长春春花花愈愈伤伤组组织织细细胞胞），用用镊镊子子不不易易分分离离。因因此此，接接种种时时先先转转入入无无菌菌培培养养皿皿中中，再再用用手手术术刀刀将将其其切切成成3mm3mm的的愈愈伤伤组组织织块块，然然后后接接种种于于新新鲜鲜培培养养基基中中，每瓶每瓶34块。块。培养过程见图培养过程见图2-2和图和图2-3。第29页/共32页图图2-1长春花愈伤组织诱导结长春花愈伤组织诱导结果果A：叶愈伤组织：叶愈伤组织B：茎愈伤组织：茎愈伤组织C：花蕊愈伤组织：花蕊愈伤组织注：注：以上结果均于以上结果均于MS培养基上暗培培养基上暗培养，诱导时间为养，诱导时间为24d。CBA第30页/共32页图2-2 长春花叶片愈伤组织细胞 MS培养基暗培养28d 接种量：0.830.02g 鲜重增长量：9.041.03g 增长倍数：10.84倍图2-3 长春花花蕊愈伤组织细胞 MS培养基暗培养28d 接种量：0.450.34g 鲜重增长量：9.070.93g 增长倍数：20.12 倍第31页/共32页感谢您的观看！第32页/共32页